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出处：重庆医科大学学报-2005.30(2)300-301
方静, 张学东，雷春涛, 李琦 ，刘朝辉 (重庆医科大学临床学院眼科，重庆 400016)
中图分类号: R774.1 文献标识码: A
摘 要 目的 探讨环丙沙星对人结膜成纤维细胞增殖抑制作用的效果。方法 应用MTT法，观察不同浓度丙沙星对人结膜成纤维细胞增殖的影响。结果 环丙沙星对人结膜成纤维细胞均有明显的抑制作用，其效果呈浓度依赖性。结论 环丙沙星对防治PVR有效，本研究为环丙沙星应用于临床提供了依据。
关键词 增殖性玻璃体视网膜病变 药物防治 环丙沙星
增殖性玻璃体视网膜病变（PVR）是眼组织对创伤修复的一种炎症反应和细胞过度增生的结果。其主要的病理特征是细胞增生，参与增生的细胞有视网膜色素上皮细胞（RPE），成纤维细胞，神经胶质细胞等。有研究发现，环丙沙星有抑制细胞增殖的作用，为了探讨环丙沙星在PVR防治中的价值，本文研究了这此种药物对成纤维细胞增殖的影响。
1 实验部分
1.1材料
1.11实验仪器 全自动酶标仪（美国Sigma公司，MDF-381型）、微量加样器（法国，Eppendprf）、微量震荡器（北京海定电子医疗仪器厂，WZ-2A型）、96孔培养板（丹麦Delta公司）、CO2培养箱（美国SHEL LAB）、超净工作台（苏州净化设备公司，Speg Air Tech）、倒置显微镜（重庆光学仪器厂，XSZ-D2）、离心机（北京医疗仪器维修厂，LHS-64-01）
1.12实验试剂 环丙沙星 （重庆制药七厂 0.2g/100ml）、5-氟尿嘧啶（重庆制药七厂0.125g/5ml）、噻唑蓝（MTT： 美国Sigma公司）、二甲基亚砜(DMSO 苏州工业园区正兴化工研究院 分析纯）、DMEM培养液（美国Sigma公司）、20%小牛血清（杭州四季青生物制品公司）、胰蛋白酶（美国Difco公司）
1.2方法
1.21原代培养：原代人结膜成纤维细胞由急性眼外伤眼球摘除后获得。细胞培养参照司徒镇强[1]的方法。DMEM培养液，内含20%小牛血清及10mg/L庆大霉素。细胞在5%CO2、37℃培养箱中培养。原代接种后每天在倒置显微镜下观察组织块贴壁情况、培养液颜色以及是否有微生物污染等，并作好记录。第3天更换1次培养液，并观察细胞生长状况及形态特征。根据需要及时更换培养液。
1.22传代培养：在显微镜下观察发现成纤维细胞生长至大部分汇合时，以0.25%的胰蛋白酶作用细胞约5-8min，再加入适量DMEM培养液终止消化，并用吸管轻轻吹打瓶壁使成纤维细胞细胞悬起、分散，以血球计数板计数细胞，调节细胞密度为1×105个/ml，接种于培养瓶继续培养，每3或4天更换1次培养液。采用培养的第3代人结膜成纤维细胞进行药物的增殖抑制试验。
1.23采用MTT法进行培养细胞的药物抑制试验。制备培养的第3代人结膜成纤维细胞混悬液，调节细胞密度为1X105/ml，接种于96孔培养板，每孔种植200ul细胞悬液。5%CO2、37℃培养箱中培养24小时后，吸去培养液，换上含5种不同浓度的环丙沙星的培养液，以不含任何药物的培养液为对照组。每个浓度及对照组均设三个平行孔，继续培养48小时后吸去培养液，每孔加入不含小牛血清的DMEM培养液100ul及MTT溶液10ul，轻轻混匀，5%CO2、37℃培养箱中培养4-6小时后弃去培养液，加入DMSO溶液100ul，置震荡器上震荡10-15分钟，选择490nm波长，在酶联免疫检测仪上测定培养板各孔的光密度A值，检测波长为490nm。实验重复3次,计算各组细胞生长抑制率：
细胞抑制率=(1—用药组平均吸光度A值/对照组平均吸光度A值)×100%
1.24统计方法：采用曲线拟合和直线回归方法。所有数据经SPSS10.0软件包统计。根据直线回归方程求出半数有效抑制量IC50。
1.3结果
环丙沙星对培养的人结膜成纤维细胞的抑制作用 实验结果表明，环丙沙星对人结膜成纤维细胞增殖有抑制作用，其抑制的程度呈浓度依赖性，抑制率与对数剂量呈直线相关（P=0.001），回归方程为：Y=-8.505+52.885X，IC50值为12.77ug/ml。倒置显微镜下观察：作用30小时后，20ug/ml以上浓度与对照组比较，细胞数量明显减少，细胞皱缩。40ug/ml以上浓度细胞欠饱满，细胞间连接欠紧密，但未见细胞死亡或飘浮。5ug/ml浓度范围作用下细胞形态同对照组无明显差别，镜下观察细胞密度差别不很明显。实验结果见表。
2 讨论
PVR是指由于孔源性视网膜脱离、眼穿通伤或眼内手术造成血-视网膜屏障受损，视网膜色素上皮细胞（RPE）进入玻璃体，继而引起RPE、神经胶质细胞、成纤维细胞等在玻璃体内增殖，形成以细胞为主的的纤维膜，后者的收缩，牵拉引起视网膜脱离，最终导致失明。其核心是细胞的增殖。PVR的病理特征是细胞增生并形成有收缩能力的增生膜，该膜收缩引起牵拉性视网脱离。当前该病尚无满意的治疗方法。手术治疗有一定的疗效，但部分患者术后PVR复发。目前已发现多种药物能抑制PVR的增殖，主要是抗代谢药物，其中最有代表性的是5-FU。但这一类药为细胞毒性药物，由于对视网膜的毒性，限制了其临床应用。因此寻找安全有效的药物防治PVR一直是眼科学家的追求。
环丙沙星是一种广泛应用于临床的氟喹诺酮类抗菌素，眼科用来作为手术后预防感染用药及治疗眼内感染。已有研究发现环丙沙星能抑制人淋巴细胞和正常造血干细胞的增殖。抑制剂量在不同文献报道不同。ARNE等用流式细胞技术测定每个细胞中的DNA含量来评价处在细胞周期的S和G2/M期的细胞占全部细胞比率,研究发现20ug/ml浓度的环丙沙星能使50%以上体外培养植物凝集素刺激的淋巴细胞处于S和G2/M期。ARNE等还观察到在培养液中加入3H标记的胸腺嘧啶，低浓度的环丙沙星（<5ug/ml）能使体外培养植物凝集素刺激的淋巴细胞中的胸腺嘧啶含量增加，而较高浓度的环丙沙星（80ug/ml）使淋巴细胞胸腺嘧啶的摄取量明显减少，这说明环丙沙星影响了嘧啶的生物合成途径。有报道较高浓度的环丙沙星在自由细胞系统中能抑制真核细胞DNA多聚酶α和β及脱氧核苷酸转移酶。高浓度的环丙沙星减少了DNA合成的数量，并抑制DNA多聚酶α和拓扑异构酶Ⅰ和Ⅱ。我们的实验发现，环丙沙星对人结膜成纤维细胞有明显抑制作用。IC50值为12.77ul/ml，抑制作用呈剂量依赖性。其机理可能是通过抑制细胞中线粒体本身的拓扑异构酶的活性，阻碍细胞周期（尤其是在最需要能量的S期和G2/M期）的进程，而抑制细胞增殖。另一个可能的机制推测是通过破坏DNA的修复或造成基因放大。环丙沙星也可能通过影响胸腺嘧啶的从头合成途径影响DNA合成，进而抑制细胞增殖。
综上所述，由于成纤维细胞在PVR的发生中的重要作用，而环丙沙星能有效抑制培养的人结膜成纤维细胞增殖，其临床运用需要进一步研究。
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