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王颖 潘志强 张文华 武宇影 接英
【摘要】目的 探讨丝裂霉素C处理Swiss-3T3成纤维细胞作为饲细胞的条件，了解兔角膜缘干细胞克隆化培养的增殖状况。
设计 对照实验研究。
研究对象 兔角膜缘干细胞单纯培养组，兔角膜缘干细胞与Swiss-3T3成纤维细胞作为饲细胞的混合培养组。
方法 采用DMEM/F12培养基进行细胞培养，观察4.0μg/ml丝裂霉素C作用不同时间后3T3细胞数量的变化。DispaseⅡ酶消化兔角膜缘上皮细胞，与饲细胞混合接种，观察干细胞克隆形成情况，比较各代、各组的细胞克隆形成率(CFE)。用EDTA去除饲细胞，间接免疫荧光染色检测角膜缘干细胞克隆团表达增殖细胞核抗原（PCNA）情况。
主要指标 细胞数/ 毫升，细胞克隆形成率。
结果 4.0μg/ml丝裂霉素C处理2.5小时的Swiss-3T3细胞，培养期间（约12日）细胞数量无明显变化，可作为饲细胞。与饲细胞共同培养的兔角膜缘干细胞形成细胞克隆团，细胞的平均CFE比较：有饲细胞组角膜缘干细胞明显高于无饲细胞组T=2.982, P<0.01。差异具有显著性。兔角膜缘干细胞冻存复苏后平均CFE比较，有饲细胞组明显高于无饲细胞组 T=3.007, P<0.01。兔角膜缘干细胞克隆团中细胞PCNA染色为阳性。
结论 角膜缘干细胞与作为饲细胞的Swiss-3T3成纤维细胞共同培养形成细胞克隆，其中含有干细胞，且具有高增殖力。
【关键词】角膜缘干细胞；饲细胞；克隆化培养；增殖细胞核抗原；体外培养
【Abstract】 Objectives To research the preparation of Swiss-3T3 cells with mitomycin C as feeder cells, examine the cloning and proliferation power of rabbit limbal stem cells. Design Comparative experimental trial. Participants The cultivated rabbit limbal stem cells and the cultivated rabbit limbal stem cells with Swiss-3T3 cells as feeder cells. Methods The cells were cultured in DMEM/F12 medium. Being treated with 4.0μg/ml mitomycin C at different time, the proliferation power of Swiss-3T3 cells were evaluated with counting cells. Rabbit limbal stem cells were digested by DispaseⅡand cultivated with the feeder cells. The cloning growth of cultivated cells was measured with colony-forming efficiency (CFE) in different groups. After feeder cells were discarded by 0.04%EDTA, the cultivated limbal stem cells were examined with immunofluorescence staining of PCNA. Main Outcome Measures Cell count/ml, CFE. Results The number of Swiss-3T3 cells treated with 4.0μg/ml mitomycin C for 2.5 hours had no significant changed during the culture period (about 12 days). Limbal stem cells with feeder cells grew as clones. The mean CFE of limbal stem cells in the group with feeder cells was more than that in the group without feeder cells T=2.982, P<0.01. Recovering from frozen, the cells with feeder cells had higher proliferating power than cells without feeder cells had T=3.007, P<0.01. The clones of cultivated limbal stem cells were positively stained by anti-PCNA in nucleolus with green fluorescence. Conclusion Limbal stem cells co-cultivated with feeder cells grow as clones, which had higher proliferating power and hinted stem cells existing.
【Key words】 Limbal stem cells; Feeder cells; Clone assay; PCNA; in vitro
角膜缘干细胞移植是治疗角膜缘损伤导致干细胞功能障碍疾病的新手段，角膜缘干细胞的体外培养是进行细胞移植的基础，通过体外扩增将获得的少量角膜缘上皮细胞数量放大并保持干细胞特性，对于临床治疗角膜缘疾病具有重要意义。研究表明，角膜缘具有特殊的“Vogt”结构，通过RNA印迹杂交等技术证明角膜缘上皮细胞与周围成纤维细胞之间存在细胞因子调控网络。通过该网络，成纤维细胞可以间接地影响角膜缘上皮细胞的增殖和分化[1]。Swiss-3T3成纤维细胞作为饲细胞已成功地应用于包括兔[2]、人[3]等多种上皮细胞培养。本研究以Swiss-3T3成纤维细胞作为饲细胞，观察其对角膜缘干细胞克隆形成的影响，研究其增殖力的生物学特性，为角膜上皮干细胞体外扩增、保存和进一步的细胞移植奠定基础。
1 材料与方法
1.1 3T3成纤维饲细胞的准备
取Swiss-3T3成纤维细胞系细胞（珠海东大实验室提供），接种于50ml培养瓶中，加入细胞培养基(GIBCO) (Hams F12与DMEM1：1混合)培养。待细胞融合达90%，0.25%胰蛋白酶-0.04%EDTA 5ml消化成细胞悬液，以1：2比例重新接种传代。3T3成纤维细胞培养到对数期（约为70%—80%），取6瓶3T3成纤维细胞加入含有4.0μg/ml丝裂霉素C的细胞培养液后，分别作用1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5小时，再加入新鲜培养液。24小时后，消化细胞以103个细胞/cm2接种于6孔板中。每2～3日换液一次。第2～12日，每日将3孔中的细胞消化，细胞计数取均值。
1.2 角膜缘干细胞克隆化培养及传代
新西兰白兔角膜缘内外2mm取材；将组织切成1mm～2mm大小，加入DispaseⅡ酶[4]，置37℃、5％CO2恒温培养箱中消化3小时，再
加入0.25%胰蛋白酶(Difco)－0.04%EDTA常温下消化3～5分钟，稀释细胞为104个细胞/ml，取6块无菌6孔板（包括有盖玻片和无盖玻片两组），每孔各加1ml角膜缘干细胞稀释液（浓度为103个细胞/cm2）和1ml Swiss-3T3成纤维细胞稀释液（浓度为104个细胞/cm2），再补加1ml/孔培养液(Hams F12与DMEM的1：1混合物，20％胎牛血清)。接种48小时后，每日置显微镜下观察记录细胞贴壁情况， 每2～3天更换一次培养液，第4天开始每日记录克隆形成数，以每个细胞团超过4个细胞为1个克隆[5]。观察克隆生长情况，观察到细胞接种后第12日，细胞单层形成达80％时以0.04％EDTA去除Swiss-3T3成纤维细胞[6]，继续传代培养角膜缘干细胞。
1.3 克隆化角膜缘干细胞的冻存和复苏
原代克隆化角膜缘干细胞消化成单个细胞后，常规方法冻存细胞[5]，采用二甲基亚砜为冻存剂，-80℃冻存细胞，复苏前准备好饲细胞，接种角膜缘干细胞，检测细胞的CFE。
1.4 克隆化角膜缘干细胞的增殖细胞核抗原（PCNA）染色
克隆化培养第3、6、9天，选取生长于盖玻片的兔角膜缘干细胞克隆细胞团各2张；同时选取培养第4天的有饲细胞和无饲细胞的角膜缘干细胞各2张，以0.04%EDTA去除饲细胞。常规间接免疫荧光染色，一抗为鼠抗兔增殖细胞核抗原单克隆抗体PC10（Calbiochem公司），荧光素FITC标记二抗羊抗鼠IgG，封片后荧光镜检并照相记录。
1.5 统计学方法
应用t检验、正态性检验等统计方法，设定P<0.05为有统计学差异。
2 结果
2.1 丝裂霉素C对Swiss-3T3成纤维细胞的影响
经4.0ug/ml丝裂霉素C处理不同时间的3T3细胞，形态较均一，24小时可贴壁，但在培养期间，其增殖能力不同。其中，丝裂霉素处理2.5小时的3T3细胞，培养期间细胞的形态及数量无明显变化（图1～3）。
图.1 4.0ug/ml丝裂霉素处理2.5小时3T3细胞培养2天(×100)
图.2 4.0ug/ml丝裂霉素处理2.5小时3T3细胞培养4天(×100)
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