出处：眼科研究-2005,5
作者：胡楠  龚启荣
单位：江苏省南通市南通医学院附属医院眼科 226001 

   摘要  目的  探讨治疗疱疹病毒性角膜炎的新药Carbocyclic oxetanocin G（C.OXT-G）耐药性的产生情况及产生耐药性的机制。 方法  将1型单纯疱疹病毒（HSV-1）接种于非洲绿猴肾细胞，在含10 μmol / L C.OXT-G的环境中连续培养20代，通过空斑抑制试验测定各代病毒株对C.OXT-G的敏感性，测定野生HSV-1、培养20代后的耐药性HSV-1及其生物克隆株的胸腺嘧啶核苷激酶的活性。 结果  HSV-1在含C.OXT-G的环境中连续传代培养4代后，便出现了耐药性。培养20代后的病毒株及其克隆株的ED50为野生株的10倍，且病毒的TK酶活性远远低于野生病毒株。 结论  HSV-1在含C.OXT-G的环境中很快产生耐药性且耐药病毒株缺乏TK酶活性。
关键词  Carbocyclic oxetanocin G；耐药性；单纯疱疹病毒；胸腺嘧啶核苷激酶
   分类号  R 988.1
   (+)-9-[(1R,2R,3S)-2,3-bis(hydroxymethyl)cyclobutyl]guanine(Carbocyclic oxetanocin G ,C.OXT-G) (图1)是一种抗病毒新药，它不仅对单纯疱疹病毒（herpes simplex virus，HSV）有效，而且对水痘－带状疱疹病毒（varicella zoster virus,VZV）、巨细胞病毒（cytomegalovirus,CMA）、EB病毒（epstein barr virus,EBV）和人类免疫缺陷病毒等均有很好的抑制作用。C.OXT-G对1型单纯疱疹病毒的抑制作用与无环鸟苷（acyclovir）相似，对疱疹病毒性角膜炎有良好的治疗作用，其在临床应用过程中是否会产生耐药性尚未见到报道。为了了解C.OXT-G的耐药性产生情况及耐药病毒产生的机制，本实验将HSV-1在含C.OXT-G的环境中连续培养后测定病毒对药物的敏感性，并对快速出现的耐药病毒进行了胸腺嘧啶核苷激酶（thymidine kinase，TK酶）活性检测。

1 材料与方法
1.1 试剂和主要仪器
   C.OXT-G由日本德岛文理大学药学院合成。HSV-1  PH株、 LM(TKˉ)细胞和 Whatman DE81 paper由日本德岛大学眼科教研室提供。[3H]thymidine : 5 mCi / mmol, 为ICN 产品。液体闪烁计数器： LSC-602, 日本。
1.2 建立耐C.OXT-G的 HSV-1
   非洲绿猴肾细胞（VERO细胞）在直径60mm的培养皿中生长，形成单层细胞，将HSV-1 PH株接种于VERO细胞（100～200 PFU / 皿），作用1 h后弃去病毒液，加入含1％胎牛血清和10μmol / L  C.OXT-G的培养液（Eagle’s minimum essential medium ，EMEM ）, 放入培养箱（37 ℃ 、 5% CO2），每天在倒置显微镜下观察、记录cytopathic effect (CPE)的数量。2～3 d后取出细胞，在－80℃超低温冰箱中冷冻半小时后溶解，释放出细胞内病毒，离心后取含病毒的上清液，再接种于含10μmol / L C.OXT-G的新鲜VERO细胞中，按上述方法连续培养到第20代。
1.3 生物克隆化（空斑纯化）
   为了使病毒具有遗传同一性，需进行生物克隆化或空斑纯化。培养20代后的HSV-1经高度稀释后接种于VERO细胞，这样仅有少数空斑形成，用巴斯德吸管随机将孤立的空斑转移至含0.5 mL培养液的冷冻管保存。经过至少2轮的纯化，得到3株纯化的HSV-1 (第20 代)，以下称它们为“克隆株”。
1.4 空斑抑制试验
   通过空斑抑制试验检测野生HSV-1、在C.OXT-G环境中生长的各代HSV-1以及第20代HSV-1的生物克隆株对C.OXT-G的敏感性。将被测病毒分别接种于VERO细胞（100～200 PFU / 皿），作用1 h后弃去病毒，加入含1％胎牛血清的EMEM和1％甲基纤维素的等量混合液，并加入不同浓度的C.OXT-G，CO2培养箱中培养3 d后用甲醛固定，结晶紫染色，记录空斑数。根据空斑数作图计算出C.OXT-G对各病毒株的半数有效浓度（the 50% effective dose, ED50），每个浓度至少测定3次。
1.5 测定TK酶活性
   按Summers的方法稍加改良后测定病毒的TK酶活性。将野生HSV-1，耐药HSV-1及其克隆株按每个细胞10个空斑形成单位的浓度接种于LM (TKˉ) 细胞，在培养箱中孵育20 h后用磷酸缓冲液冲洗1遍，加入0.02 mol /L Tris-HCL、1mmol /L巯基乙醇和0.05 mmol /L胸腺嘧啶核苷的混合液0.2 mL（pH=7.8），反复冷冻 － 溶解2～3次，置超声波振荡器上作用1min以粉碎细胞，4 ℃下离心20min，所得上清液即为含酶的待测样本。取上清液40μL，加入含0.15 mol /L Tris-HCL、16 mmol /L MgCl2、16 mmol /L ATP、25 mmol /L NaF、8 mmol /L 肌磷酸、1μmol/(min·mL)肌酸激酶和0.2 mmol /L [3H]胸腺嘧啶核苷的混合液120 μL（pH =7.8），在37 ℃ 水浴箱中分别孵育30、60、90和120 min， 取20 μL滴在直径为2 cm的Whatman DE81纸上，烘干后经液体闪烁计数器测定放射线活性。

2 结果
2.1 耐药HSV-1的产生
   HSV-1在含C.OXT-G的环境中连续传代培养，很快便出现了耐药性。培养4代后，C.OXT-G对病毒的ED50 从1.85 ´ 10-7 mol / L 上升为 1.51 ´ 10-6 mol/ L，表明病毒耐药性已经产生，培养20代后，耐药病毒株的ED50为野生株的10倍，其克隆株的ED50与耐药株相似（图2,表1）。

   a.C.OXT-G dosage required to inhibit plaque formation by 50 percent of the control one.
   b. TK activities of the viruses after incubation at 37℃ for 120 min.
   c. C.OXT-Gr = C.OXT-G resistant strain

2.2 TK酶活性
   经各病毒株感染及未经病毒感染的LM细胞的TK酶活性测定结果见图3及表1。野生HSV-1的TK酶活性随时间的延长迅速升高，而耐药病毒株（第20代）及其克隆株的TK酶活性则受到明显抑制。

3 讨论
   无环鸟苷是非常有效的抗病毒药物，已广泛应用于疱疹病毒性角膜炎的局部及全身治疗，但迅速出现的耐药性病毒株是其面临的一大问题，此外，无环鸟苷的水溶性极低，使其难以作为滴眼液应用于临床。因此，各地学者一直在寻找更为安全有效的抗病毒药物。最近有报道认为C.OXT-G 有良好的抑制HSV、VZV、CMV和 EBV的作用。C.OXT-G的鸟嘌呤附着于环丁烷上（图1），水溶性很好，可以配制成滴眼液局部应用，对兔及人疱疹病毒性角膜炎均有良好的治疗效果，且无明显的药物毒副作用。
   目前C.OXT-G已用于疱疹病毒性角膜炎及其他HSV所致疾病的临床治疗，因此有必要了解用药后病毒是否会产生耐药性以及耐药病毒的特性。为了确定HSV-1对C.OXT-G产生耐药性的速度，我们将野生HSV-1接种于含10 μmol / L C.OXT-G的VERO细胞中连续培养，仅经过4代培养，病毒就产生了明显的耐药性，到第6代，病毒对药物的敏感性仅为野生株的十分之一，而此后耐药性不再增加，一直持续到第20代。
   与ACV相似，C.OXT-G在病毒的TK酶作用下形成单磷酸化物并进一步磷酸化为三磷酸C.OXT-G，而后者能抑制病毒DNA聚合酶。对药物作用机制的研究已表明，C.OXT-G抗HSV的作用至少部分依赖于病毒诱导的TK酶参与的磷酸化过程，提示此过程的消失或改变可能与病毒耐药有关。本实验中，经过20代连续培养，病毒的TK酶活性远远低于野生病毒株，证实了病毒TK酶活性的降低或缺乏是引起病毒耐药性产生的原因。
   本实验采用一种简单而敏感的方法测定TK酶活性，其基本原理如下：LM (TKˉ)细胞是LM鼠的成纤维细胞在含25 μg/mL BUdR (5-bromo-2-dexyuridine) 的环境中连续生长90周后形成的缺乏TK酶活性的细胞株，待测病毒感染该LM (TKˉ) 细胞后所产生的TK酶全部为病毒诱导的TK酶。在待测样本中加入[3H]胸腺嘧啶核苷，如有TK酶活性存在，则[3H]胸腺嘧啶核苷被磷酸化。将样本点在DE81纸上，磷酸化的[3H]胸腺嘧啶核苷被滤纸吸附，而未磷酸化的[3H]胸腺嘧啶核苷则被酒精冲走。最后在液体闪烁计数器上测定DE81纸上的放射线活性就可得到TK酶的活性。
   HSV-1在含C.OXT-G的环境中很快产生耐药性且耐药病毒株缺乏TK酶活性，这一结论为评估临床上病毒耐药性的产生打下了基础，并有助于临床医生正确地面对由于病毒耐药性带来的治疗难题。下一步我们将对耐药病毒株进行基因分析，进一步明确耐药性产生的机制。

Fig.2  ED50 for C.OXT-G following each passage of HSV-1 in the presence of C.OXT-G. The ED50 of C.OXT-G to virus was increased from 1.85 ´ 10-7 mol / L to 1.51 ´ 10-6 mol/ L in the 4th passage of HSV-1 after cultured with 10 µmol /L of C.OXT-G, showing the emergence of resistant virus. By the end of the 20th passage, the ED50 of the resistant strain was 2.39´ 10-6 mol/ L.

Fig 3. TK activity of the supernatants of LM(TK-) cells infected with the PH strain, 
C.OXT-Gr strain and its clones. In the wild PH strain, viral TK activity increased markedly, but in C.OXT-G resistant strain and its clones, reduced.