出处：中华眼科杂志-2005,41（9）：837－841
作者：刘庆淮* 谢平 戈应滨 袁孝如

【摘要】 目的：进一步探讨NO及其合酶在糖尿病视网膜氧化损伤中的作用。方法： 链脲佐菌素制备大鼠糖尿病模型，注射生理盐水作为对照，分别取正常对照及模型制备成功后2W及20W大鼠视网膜标本进行以下实验：1．利用免疫组化及图象处理技术，分析硝基酪氨酸在视网膜中的分布及含量。2。利用免疫组化及RT—PCR技术，测定iNOS及nNOS的蛋白及mRNA表达。 结果： 糖尿病大鼠视网膜内的NT在糖尿病2W大鼠的表达升高，但阳性细胞只分布于神经节细胞层，提示糖尿病大鼠的视网膜损伤首先发生在神经节细胞层。糖尿病20W的大鼠NT表达量明显增高，并且阳性细胞遍布视网膜全层，显示随糖尿病病程进展视网膜氧化损伤进行性加重，NO产生增多；和对照相比，糖尿病2W大鼠的iNOS表达增加，nNOS表达下降，糖尿病20W大鼠的iNOS进一步增加，而nNOS几乎消失，提示糖尿病大鼠视网膜内NO产生增多和nNOS表达下降与iNOS表达升高有关。 结论： 糖尿病对视网膜组织的损害首先是发生在神经节细胞，进而神经节细胞以前的视网膜功能受损，糖尿病早期视网膜组织的损伤是以神经节细胞层为主；糖尿病大鼠模型中，视网膜损伤和NO的升高关系密切，而NO含量升高是nNOS表达下降和iNOS表达升高的结果。
【关键词】 视网膜病变；糖尿病；一氧化氮合酶； 3-硝基酪氨酸；大鼠

   糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy，DR）是糖尿病微血管病变在眼底独特环境中的表现，长期慢性的高血糖是其发病的基础，并受全身新陈代谢、内分泌及血液等多方面因素的影响，其中心环节是高血糖及其引起组织缺氧发生的一系列改变。在DR的诸多致病因素中，“活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）损伤”越来越引人关注。高血糖可以使一种ROS—— 一氧化氮（Nitrogen monoxide, NO）在视网膜中产生增多，目前仅有为数不多的研究报道了在早期糖尿病大鼠的视网膜中，NO参与了糖尿病视网膜微血管损伤的病理过程，但是中长期糖尿病的视网膜中NO及其合酶在视网膜损伤中的作用目前还没有报道。因此本研究利用链脲佐菌素建立糖尿病大鼠模型，分别检测不同阶段糖尿病大鼠视网膜内3－硝基酪氨酸（3－Nitrotyrosine，3－NT）以及NO相关合酶的表达，希望能初步阐明它们在DR发病机制中的作用。

材料和方法
一．材料
   江苏省实验动物中心提供健康成年封闭群雄性SD （Sprague-Dawley）大鼠40只，约10周（W）龄，体重180～220g，眼部经裂隙灯和检眼镜检查见屈光间质清晰，眼底无病变。链脲佐菌素（streptozotocin，STZ），美国Sigma公司产品。TRIZOL试剂（GIBCOBRL公司）；反转录－PCR试剂盒（TaKaRa公司）；硝基酪氨酸单克隆抗体（晶美公司）；诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthetase ，iNOS）和神经型一氧化氮合酶（neuronal nitric oxide synthase，nNOS）多克隆抗体（武汉博士德生物技术有限公司）；免疫组化染色试剂盒（POD，AP）、DAB（北京中山生物技术有限公司）；DNA Marker DL2000(TaKaRa公司)；焦碳酸二乙酯（DEPC，上海生工生物工程技术服务有限公司）；血糖试纸（SureStep Hospital 稳步医院用血糖试纸条，美国LIFESCAN公司产品）。其它试剂均为分析纯，购自南京化学试剂公司。实验中所用的各种缓冲液均为南京医科大学生理学教研室配制。

二、方法
1．STZ诱导大鼠糖尿病模型
   STZ溶解在0.1mmol/L（pH4.5）灭菌枸橼酸盐缓冲液中，浓度为1%，使用前临时配制。大鼠禁食12h后，按65 mg/kg剂量一次性腹腔内注射1%STZ溶液。建模标准：给药48h、72h后连续2次以无菌的1ml一次性塑料TB针管接9号针头大鼠尾静脉穿刺取全血检查空腹血糖，用试纸测量尿糖，血糖>16.65 mmol/L，尿糖在(+++)以上者为糖尿病大鼠模型建立成功。
   分别在建模成功后2W和20W，处死动物。一侧眼球取视网膜置于1ml 冰冷的TRIZOL试剂中，另一侧眼球剔除角膜和玻璃体制成眼杯固定于4%多聚甲醛（0.1M PB Buffer pH 7.4）中12h以上，石蜡包埋，常规切片用于免疫组化染色。去除实验过程中死亡动物，实际用于实验的2W糖尿病大鼠7只，20W糖尿病大鼠10只，动物处死前均禁食18－20h。
2、 RT-PCR
   使用TRIZOL试剂，提取各组视网膜总RNA，反转录得到cDNA产物。PCR引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。iNOS：（F：5’ CTG CAT GGA ACA GTA TAA GGC AAA C，R：5’ CAG ACA GTT TCT GGT CGA TGT CAT GA，216bp），nNOS：(F：5’ GCG GAG CAG AGC GGC CTT AT, R：5’ TTT GGT GGG AGG ACC GAG GG，221bp)，GAPDH（F：5’ TCC CTC AAG ATT GTC AGC AA，R：5’ AGA TCC ACA ACG GAT ACA TT，216bp）。分别取2μl模板进行iNOS与nNOS的PCR反应，GAPDH作为内参照。共35个循环，褪火温度iNOS 57℃，nNOS 61℃。取PCR产物6μl，1.5%琼脂糖(TBE，含溴乙锭0.5μl/ml)凝胶电泳，进行吸光度积分扫描。
3、免疫组化
   切片脱腊进水，放入0.01M的枸橼酸钠缓冲液中(pH=6.0)煮沸15min进行抗原修复后，进行iNOS、nNOS和3-NT的SP染色，DAB发色后苏木精对染，光镜下观察。细胞浆内出现棕色颗粒阳性细胞。
4、计算机图象处理
   每组标本随机取三张免疫组化染色切片，以图像分析仪（NYD1000）对染色结果进行分析，每张切片随机取10个高倍视野，计算染色的阳性细胞平均数。
5、统计学处理
   免疫组化阳性细胞平均数用平均数±标准差（mean±SD） 表示。单因素方差分析法分析各组之间的差异，P<0.05认为有显著性差异。

结果
1、3-NT免疫组化染色
   对照组大鼠视网膜内3-NT阳性细胞为阴性；糖尿病2W的大鼠视网膜内仅有3-NT阳性细胞散在分布，并且主要集中于神经节细胞层，阳性细胞平均数为17.01±3.12（表1）；而糖尿病20W的大鼠视网膜内3-NT阳性细胞数显著增多，神经节细胞层、内核层和外核层均有存在（图1），阳性细胞平均数为28.20±2.73。统计学分析各组3-NT阳性细胞平均数之间有显著性差异。

注释：
1．3-NT：3－硝基酪氨酸（3－Nitrotyrosine）
   对照组大鼠视网膜内3-NT阳性细胞为阴性；糖尿病2W的大鼠视网膜内3-NT阳性细胞平均数为17.01±3.12；糖尿病20W的大鼠视网膜内3-NT阳性细胞平均数为28.20±2.73。统计学分析各组3-NT阳性细胞平均数之间有显著性差异（P<0.05）。
2．iNOS：诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthetase）
   对照组大鼠视网膜内iNOS阳性细胞为阴性；糖尿病2W的大鼠视网膜内阳性细胞平均数为13.03±0.72；糖尿病20W的大鼠视网膜内iNOS阳性细胞平均数为34.20±0.93。统计学分析各组iNOS阳性细胞平均数之间有显著性差异（P<0.05）。
3．nNOS：神经型一氧化氮合酶（neuronal nitric oxide synthase）
   对照组大鼠视网膜内nNOS阳性细胞平均数为27.32±3.10；糖尿病2W的大鼠视网膜内nNOS阳性细胞平均数为14.04±0.82；糖尿病20W的大鼠视网膜内nNOS阳性细胞为0。统计学分析各组nNOS阳性细胞平均数之间有显著性差异（P<0.05）。

2、iNOS及nNOS 免疫组化染色
   对照组大鼠视网膜内几乎没有iNOS阳性细胞；糖尿病2W的大鼠视网膜内仅有iNOS阳性细胞散在分布，并且主要集中于神经节细胞层，阳性细胞平均数为13.03±0.72；而糖尿病20W的大鼠视网膜内iNOS阳性细胞数显著增多，分布于神经节细胞层、内颗粒层细胞层、外颗粒层细胞层、视细胞层等视网膜各层（图2），阳性细胞平均数为34.20±0.93。
   nNOS阳性细胞存在于对照组大鼠视网膜内，阳性细胞平均数为27.32±3.10；糖尿病2W的大鼠视网膜内nNOS阳性细胞显著减少，阳性细胞平均数为14.04±0.82；而糖尿病20W的大鼠视网膜内nNOS阳性细胞几乎完全消失（图3）。统计学分析各免疫组化阳性细胞平均数之间有显著性差异。

3、iNOS及nNOS mRNA的RT－PCR结果
   iNOS及nNOS mRNA的RT－PCR结果证实了其免疫组化的结果。随着糖尿病病程进展，和正常对照组大鼠相比，糖尿病大鼠视网膜内iNOS的mRNA表达增高，而nNOS的mRNA表达降低（图4）。

讨论
1．氧化损伤在DR病理过程中的作用
   ROS是指较O2化学性质更为活跃的O2代谢产物及其衍生的含氧物质的总称，葡萄糖的自身氧化和糖蛋白的传递作用均可产生ROS。糖尿病中，高血糖主要通过山梨醇途径激活NADPH氧化酶系统导致ROS生成增多，ROS使蛋白质糖化、细胞膜和细胞质内的不饱和脂肪酸氧化，这些氧化产物产生的细胞毒作用能损伤血管内皮细胞，是糖尿病微血管损伤的主要原因。而且，何剑峰等发现糖尿病大鼠视网膜组织中SOD与过氧化氢酶（CAT）的活性与正常组相比显著下降，这表明其自由基防御机能下降，糖尿病大鼠视网膜组织抗氧化机能处于明显低下状态，提示氧化损伤在DR发生发展中起重要作用。
2．NO与糖尿病大鼠视网膜组织损伤的关系
   高血糖可以使一种ROS—— 一氧化氮（Nitrogen monoxide, NO）在视网膜中产生增多，升高的NO和组织中的超氧阴离子（O2－）可快速反应生成过氧亚硝基阴离子（ONOO－）。 ONOO－是强氧化剂，它一方面发挥细胞毒作用,导致细胞损伤或死亡；另一方面导致酪氨酸硝基化生成3-NT，而酪氨酸硝基化会给组织细胞带来损伤。3-NT是目前公认的组织中ONOO－生成的一个稳定的生物学标识物及酪氨酸硝基化的标志，可作为这种过度氧化活动的化学标记物。应用免疫组化方法检测视网膜组织中3-NT的分布和含量可以间接反应组织中NO含量和O2－的含量，反应组织中氧化损伤的程度和状态。
   我们研究的结果显示，正常大鼠视网膜内几乎没有3-NT阳性细胞，糖尿病2W的大鼠视网膜内出现3-NT的阳性细胞（平均数为17.0±3.1），主要分布于神经节细胞层，显示此时视网膜内神经节细胞层已经受到了氧化损伤和功能损害，时间早于以往的文献报道。糖尿病后期（20W）3-NT阳性细胞平均数显著增加到28±2.7，范围由神经节细胞层(Ganglion cell layer, GCL) 扩大到内核层(inner nuclear layer, INL)和外核层(outer nuclear layer ,ONL)，这些结果提示糖尿病大鼠视网膜的损伤程度与过量NO生成关系密切，氧化损伤在DR发生发展中起重要作用。
3．iNOS和nNOS在糖尿病大鼠视网膜损伤的病理过程中的调节作用
   NO是氧分子和L－精氨酸在一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS)的催化下产生的，NOS有三种同工酶，分别是神经型一氧化氮合酶（neuronal nitric oxide synthase，nNOS）、诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthetase ，iNOS）以及内皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase ，eNOS）。其中，eNOS与nNOS产生生理浓度的NO和O2－对于维持正常血管的调节以及神经信息的传导是必需的，而iNOS产生的NO长期大量释放则参与病理生理中的细胞毒作用。目前仅有为数不多的研究报道了在链脲佐菌素所致早期糖尿病大鼠（糖尿病2W）的视网膜及其高浓度葡萄糖培养的牛视网膜内皮细胞NO含量增高、iNOS表达增加，并且NO可使血管－视网膜屏障通透性增高，提示视网膜损伤和iNOS及其产生的NO有关。
   由于视网膜的血管结构缺乏交感神经支配, 内皮素和一氧化氮/一氧化氮合酶系统(ET-NO/NOS)等局部因子调节是维持视网膜毛细血管张力的主要原因,并且位于无长突细胞内的nNOS和视网膜血管结构关系密切。已知在大脑皮质，含nNOS神经元释放的NO可以直接调节脑血流量。nNOS释放的NO可能起类似于大脑皮质内NO相类似的功能，对视网膜血循环有重要意义，是视网膜微循环的重要调节因素，研究发现含nNOS细胞数量减少可导致糖尿病人视网膜血流量减少；并且还有研究发现，nNOS产生的NO还有维持正常的视功能的作用：nNOS能够催化感光细胞、双极细胞产生少量维持生理作用的NO，刺激感光细胞产生鸟苷酸环化酶,增加钙离子通道流量,促进光反应的产生。
   我们研究的结果发现，iNOS的阳性细胞在正常大鼠视网膜几乎不存在；随着糖尿病进程发展，2W时iNOS阳性细胞散在分布于大鼠视网膜组织，高倍视野下平均计数为13.0±0.7；而糖尿病20W的大鼠视网膜内iNOS阳性细胞数显著增多，阳性细胞平均数达到34±0.9；iNOSmRNA的RT－PCR结果证实了上述免疫组化的结果。同时我们也发现，与iNOS的变化相反，nNOS阳性细胞在正常大鼠视网膜组织广泛存在，高倍视野下平均计数为27±3.1；随糖尿病进程发展，nNOS的阳性细胞减少，糖尿病2W时平均计数降为14±0.8；而到糖尿病20W，大鼠视网膜内nNOS阳性细胞几乎完全消失；与此相对应，nNOS的mRNA表达也随着病程的进展而下降。因此我们推测，糖尿病视网膜内NO的变化是iNOS活性增高与nNOS活性降低共同作用的结果，iNOS与nNOS活性的变化对糖尿病视网膜的损伤具有关键性的调控作用。在DR的病理过程中，虽然早期nNOS产生的NO可通过扩张血管、增加血供保护视网膜神经细胞，但是随着病程的进展，这种保护作用因为nNOS的活性的降低而显得越发微不足道，并且iNOS生成的过量NO，通过细胞毒与细胞抑制作用参与DR并发症的损伤机制。
   因此我们认为在DR的病理过程中，尤其是在疾病早期，如果能够有效调控催化NO合成主要限速物质NOS的两种同工酶——iNOS和nNOS的活性，对于延缓糖尿病视网膜组织的损伤和视功能的维持具有重大意义。

*作者单位：210029 南京，南京医科大学第一附属医院眼科(刘庆淮、谢平)；南京医科大学生理学教研室（戈应滨、袁孝如）
通讯作者：刘庆淮，E-mail：olddog9@tom.com