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出处：江苏医药-2005,31(2),110－112
作者：谢平 刘庆淮 戈应宾 袁孝如
【摘要】 目的 探讨糖尿病视网膜损伤和转化生长因子-β2(transforming growth factor-β2，TGF-β2)产生的关系以及TGF-β2的作用机制。 方法 脲佐菌素制备大鼠糖尿病模型，用Western blot方法检测不同病程糖尿病动物模型（2周及20周）视网膜中TGF-β2的表达，RT-PCR测定其受体TGF-βRⅠ及TGF-βRⅡ的表达。 结果 糖尿病大鼠视网膜内TGF-β2随糖尿病进展表达增加，其受体TGF-βRⅠ的表达和对照组相比无显著差异，而TGF-βRⅡ的表达显著增加。 结论 TGF-β2在糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy，DR）形成过程中有重要作用，并有可能通TGF-βRⅡ型受体起作用。
【关键词】 转化生长因子-β2 受体 视网膜病变 糖尿病 大鼠
近年来研究表明，糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy，DR）的发生发展和血管内皮细胞的增殖调控失常有关，其中细胞因子在DR的病理过程中发挥着十分关键的作用。目前已经发现参与新生血管生长的细胞因子较多，其中血管内皮细胞生长因子(vascular endothelium growth factor, VEGF)被公认在血管生成中作为一个中心调节者，其它血管生成因子的血管生成作用是全部或部分通过增强VEGF的表达及生成作用实现的。转化生长因子-β2(transforming growth factor-β2，TGF-β2)是具有多种调节功能的细胞因子，作用较复杂，根据不同的组织来源、细胞种类和条件，既可以促进也可以抑制细胞的生长和分化。对于其在DR的病理过程中的作用，不同学者的观点各异，究其原因可能是不同的作者采用的动物或者细胞模型不同所引起的，为进一步研究TGF-β2在DR发生发展过程中的作用及机制，我们利用Western Blot和RT-PCR方法检测了糖尿病大鼠视网膜内TGF-β2及其受体的表达。
材料与方法
一、材料
江苏省实验动物中心提供健康成年封闭群雄性SD （Sprague-Dawley）大鼠40只，约10周龄，体重180～220g，眼部经裂隙灯和检眼镜检查见屈光间质清晰，眼底无病变。链脲佐菌素（streptozotocin，STZ），美国Sigma公司产品。TRIZOL试剂（GIBCOBRL公司）；反转录－PCR试剂盒（TaKaRa公司）；Actin多克隆抗体（Sant Cruz）；TGF-β2多克隆抗体（武汉博士德生物技术有限公司）； DNA Marker DL2000(TaKaRa公司)；焦碳酸二乙酯（DEPC，上海生工生物工程技术服务有限公司）；Nuclear Extract Kit (active motif 公司)；标准蛋白质(上海西巴斯生物技术开发有限公司)；硝酸纤维素膜(南京生兴生物技术有限公司)；免疫印迹发光底物(Pierce公司)。其余化学试剂均为分析纯(南京化学试剂公司)。实验中所用的各种缓冲液均为南京医科大学生理学教研室配制。
二、方法
1、动物模型制备
实验动物随机取6只，腹腔注射枸橼酸盐缓冲液作为阴性对照，其余动物禁食12h后，按65 mg/kg体重一次性腹腔内注射1%STZ溶液。建模标准：给药48h、72h后连续2次以无菌的1ml一次性塑料TB针管接9号针头大鼠尾静脉穿刺取全血检查空腹血糖，用试纸测量尿糖，血糖仪（美国LIFESCAN公司产品，SureStepTMPlus）测定血糖>16.65 mmol/L，尿糖在(+++)以上者为糖尿病大鼠模型建立成功。分别在建模成功后2周和20周，处死动物。一侧眼球取视网膜置于1ml 冰冷的TRIZOL试剂中，另一侧眼球取视网膜置于Nuclear Extract Kit的匀浆缓冲液中用于Western blot。去除实验过程中死亡动物，实际用于实验的2周糖尿病大鼠7只，20周糖尿病大鼠10只，动物处死前均禁食18－20h。
2、 RT-PCR
1)RNA提取
为防止RNA酶对RNA的降解作用，RNA提取过程中所用溶液均用0.1%DEPC水处理并高压灭菌，玻璃器皿于180℃干烤8小时，离心管及枪头等塑料制品均用DEPC水浸泡过夜后高压灭菌（具体方法略）。
2)引物合成
引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
3) RT-PCR
（1）逆转录：按反转录－PCR试剂盒说明书进行。
（2）PCR扩增 （方法略）
（3）PCR产物测定（方法略）
3、Western blot
1) 蛋白提取（方法略）
2)免疫印迹（方法略）
结果
一、Western blot
和对照组相比，糖尿病大鼠视网膜内TGF-β2表达量随病程进展而增高（图1）。
二、RT-PCR
和对照组相比，糖尿病大鼠视网膜内TGF-β2受体mRNA表达量，Ⅱ型受体TGF-βRⅡ的表达随病程进展而增高，而Ⅰ型受体TGF-βRⅠ的表达随病程进展无显著变化（图2）。
讨论
越来越多的证据表明一种特异性细胞因子所激发的细胞反应不是孤立的，而是依靠其它调节因素的存在，VEGF也不例外。现有研究显示，VEGF是最直接的血管内皮细胞促分裂素，随糖尿病病程进展和视网膜损伤加重而分泌增多，并和新生血管的形成呈正相关。而TGF-β2在DR新血管形成过程中所起的作用，至今未有定论。TGF-β2是具有双向调节功能的生长因子，是细胞增生、分化，细胞外基质和免疫应答的有效调节因子，生理功能主要体现在①促进间充质衍生细胞，如纤维母细胞和平滑肌细胞；②具有抑制包括上皮、内皮、淋巴来源的多种类型细胞增殖的能力；③可刺激细胞外基质蛋白（extracellular matrix，ECM）合成；④在细胞的趋化和粘附中起一定的调节作用，是单核细胞强烈的趋化剂。有研究表明TGF-β2对上皮细胞和内皮细胞的生长起抑制作用，是DR新血管形成过程中的抑制因子，但也有结论完全相反的报道。
我们利用Western blot方法测定糖尿病大鼠视网膜组织中TGF-β2的表达，发现在糖尿病大鼠视网膜中TGF-β2的表达增加，并随病程进展而增加（20W多于2W），提示TGF-β2的增加与DR后期病情的发展有关。而在DR后期的病理改变主要以细胞的增殖性改变为主，TGF-β2可能和VEGF相互协同，共同发挥作用，主要体现在：①TGF-β2是单核细胞、巨噬细胞、嗜中性细胞、平滑肌细胞和成纤维细胞有效的趋化因子，而这些细胞能释放VEGF等新生血管生长因子。②TGF-β2和低氧协同诱导VEGF启动子活性，在转录水平促进人类VEGFmRNA表达。③TGF-β2可增强VEGF所诱导的浸润和管腔成型，促进新生血管形成。④TGF-β2还可诱导其它生长因子（如PDGF、bFGF）的表达，成为VEGF的增效剂。
目前已经明确TGF-β2通过2个主要的丝氨酸/苏氨酸激酶受体（Ⅰ型和Ⅱ型）来传递信号，TGF-βⅠ型，Ⅱ型受体形成的异二聚体在TGF-β信号传导中起主导作用。TGF-β首先直接与TGF-βⅡ型受体结合，形成复合物。此时TGF-β构象发生改变，从而可被TGF-βⅠ型受体所识别并结合．形成TGF-βRⅡ－TGF-β－TGF-βRⅠ复合物，复合物中的Ⅰ型受体被Ⅱ型受体磷酸化，磷酸化的Ⅰ型受体将信号放大并进一步向后传递，从而产生相应的生物学效应。
RT－PCR方法测定TGF-β2受体TGF-βRⅠ及TGF-βRⅡ在糖尿病大鼠视网膜的表达的结果发现随着糖尿病进展TGF-βRⅡ明显增加，而TGF-βRⅠ没有明显改变。这提示DR后期TGF-β2与TGF-βRⅡ的表达增加相关，似乎与TGF-βRⅠ没有必然联系，这可能与它们不同的特性有关，Takeuchi[7]等发现TGF-βRⅠ与细胞外基质的合成有关,而TGF-βRⅡ则与细胞增殖有关，而在DR后期的病理改变主要以细胞的增殖性改变为主。
本研究初步发现了在糖尿病大鼠视网膜上TGF-β2及其受体在DR病理过程中的表达差异，而TGF-β2 、TGF-βRⅠ和TGF-βRⅡ在DR的病理过程中确切的调控机制还有待进一步进行研究。
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