出处：国际眼科，2005，5（2）：246-249

作者：黄玲1   王丽丽1  王海燕2  郝安平1  杨新光1  
（1西安市第四医院眼科，陕西  西安  710004，2第四军医大学西京医院眼科，陕西  西安  710033）

关键词：Dispase蛋白酶    玻璃体后脱离   
中图号：R776        文献标识码：A

摘要： 目的： 研究Dispase蛋白酶诱导玻璃体后脱离的效果和安全性。  方法：  24只健康成年的青紫兰兔随机分为4组，每组六只兔右眼均为实验眼，左眼为对照眼。A~D组实验眼玻璃体腔内分别注射Dispase蛋白酶0.0025U/0.1ml、 0.005U/0.1ml、 0.0125U/0.1ml和 0.025U/0.1ml，对照眼均为眼用平衡盐BSS液 0.1ml。注药前后行检眼镜、裂隙灯和VOLK+90D前置镜以及B超和视网膜电图(electroretinogram,ERG)检查，最后取眼球扫描电镜和透射电镜观察。  结果：电镜结果A组实验眼无PVD发生；B、C两组实验眼中各有4只眼发生完全性PVD，发生率为66.7%；D组实验眼有5只眼发生完全性PVD，发生率为83.3%；透射电镜观察对照眼及A、B两组实验眼视网膜组织结构正常。C、D组视网膜细胞和细胞器出现水肿和变性。ERG检测A、B两组术后b波振幅与术前比较无明显降低（P >0.05）；而C、D两组实验眼术后b波振幅较术前明显降低（P <0.01）。   结论： 浓度0.005U/0.1ml 的 Dispase蛋白酶可有效的诱导PVD且对视网膜无明显的毒性作用。更高浓度的Dispase蛋白酶虽然可迅速有效的诱导完全性PVD，但对视网膜有毒性作用。

引言
   玻璃体后脱离指玻璃体后界膜和视网膜内界膜表面的分离（posterior vitreous detachment, PVD），它对许多眼底疾病的病程和预后起到了重要作用。同时对简化玻璃体视网膜手术，减少手术并发症和提高手术成功率创造了条件。最近国内外开始尝试药物性PVD的研究，希望成为玻璃体切割手术的辅助方法。本研究通过对兔眼玻璃体腔内注射Dispase蛋白酶，观察不同浓度的Dispase蛋白酶诱导产生PVD的效果及安全性。

1材料和方法
1.1  动物分组
   由第四军医大学动物实验中心提供的健康成年青紫兰兔24只48眼，体重2.0～2.5kg， 雌雄不分。随机分为A、B、C、D四组每组各6只兔子。其中A组实验眼玻璃体腔内注射Dispase蛋白酶0.0025U/0.1ml，B组0.005U/0.1ml，C组0.0125U/0.1ml，0.025U/0.1ml，对照眼均为眼用平衡盐BSS液 0.1ml。
1.2  主要试剂及仪器
   Dispase蛋白酶（Sigma Corp,St,Louis,MO）于-20oC储存，使用时室温下溶于无菌眼用平衡盐液（BSS）配制最终浓度。Scan1000型3D/B/A眼部B 超（加拿大OTI公司），SDY-2000型视网膜电生理检查仪（烟台远东机电技术实业公司），S-520型扫描电子显微镜（日本HITACHI公司），JEM-2000EX透射电子显微镜（日本JEOL公司）
1.3  实验方法
1.3.1  动物给药 所用兔子双眼在玻璃体施加实验因素前均行裂隙灯、VOLK+90D前置镜、B超及视网膜电图(electroretinogram,ERG)检查。兔闸固定，复方托品酰胺充分散瞳，用0.1%爱尔卡因表面麻醉，前房穿刺抽出适量的前房水以防止注射后眼压升高。设置右眼为实验眼，左眼为对照眼。用一次性皮试针在角膜缘后2mm巩膜处间接检眼镜直视下向玻璃体腔注射A组实验眼玻璃体腔内注射Dispase蛋白酶0.0025U/0.1ml，B组Dispase蛋白酶0.005U/0.1ml，C组Dispase蛋白酶0.0125U/0.1ml，D组Dispase蛋白酶0.025U/0.1ml，对照组注射眼用平衡盐BSS液 0.1ml。拔针后用湿棉签按压1分钟以避免药液漏出。
1.3.2  术后肉眼及B超观察  术后1h、1、3、5、7d充分散瞳，用裂隙灯、VOLK+90D前置镜、间接检眼镜观察眼前节、玻璃体及眼底情况。术后1h、1、3、5、7d行B超检查有无PVD的发生以及对视网膜的影响。
1.3.3  ERG检测  记录兔子玻璃体腔注药前后双眼ERG全视野暗适应最大反应。ERG检测采用SDY-2000型视网膜电生理检查仪。记录在兔子清醒状态下进行，检查前用复方托品酰胺充分散大瞳孔，将兔子置于暗室内暗适应30分钟，1%爱尔卡因表面麻醉。闪光刺激器发射单次白色闪光，标准闪光强度，闪光灯距被测眼15cm。记录电极为角膜接触镜电极，置于被测眼角膜表面，参考电极及地电极为Ag-AgCl盘状电极，将兔两耳用75%酒精清洁后分别置于两耳。计算机自动处理并打印结果。
1.3.4  电镜观察  A、B、C、D四组的所有兔子于注药后第7天在完成活体检查后经耳缘静脉注射空气栓塞处死并迅速摘除两侧眼球。在上方角膜缘12点处用缝线做方向标记，清除眼球外筋膜组织，沿角膜缘除去角膜以利固定液渗入。注意在眼球摘除及分割过程中避免眼球直接受力而影响实验结果。2.5%戊二醛溶液固定24小时制成扫描电镜标本，检查后极部、赤道部、基础部视网膜玻璃体分离情况，另从眼球后极部取1mm×5mm大小的全层组织，制作超薄切片，经醋酸铀和枸橼酸铅双重染色，透射电镜观察PVD的发生情况及观察视网膜细胞超微结构的改变。
1.3.5  统计学处理  采用SPLM 统计分析软件对数据进行t检验统计分析。

2结果
2.1  临床所见
   经裂隙灯前置镜和间接检验镜检查发现注药后第1d前房穿刺后深度恢复正常。实验眼注药后连续观察角膜透明，但出现前房渗出（17/24），玻璃体有不同程度的混浊及絮状飘浮物（21/24）。另外，C、D两组实验眼还出现视网膜片状出血，主要集中在视乳头周围。3d后随着观察时间的延长，前房反应及玻璃体的混浊程度逐渐减轻，但D组有1实验眼出现晶体混浊。至术后7d A、B两组前房渗出及玻璃体混浊全部吸收。C、D组实验眼视网膜出血部分吸收。对照眼无明显阳性反应。B型超声波检查实验眼术后玻璃体腔内出现程度不同的点状回声，B、C、D组视网膜表面发现运动活跃，弱回声的带状弯曲光带（10/24）。各实验组术后7d临床观察情况见（Tab 1）。对照眼无明显阳性表现。

2.2  超微结构观察
2.2.1  扫描电镜  
   扫描电镜观察范围从锯齿缘到视乳头区。各组对照眼玻璃体视网膜附着，视网膜表面胶原纤维密集。A组内界膜表面玻璃体后皮质残留，无PVD发生； B、C、D组实验眼后极部及赤道部内界膜表面光滑，基底部表面有稀疏的胶原纤维与内界膜相粘连。B、C组实验眼中各有4只眼发生完全性PVD，PVD的发生率为66.7%；D组实验眼中有5只眼发生完全性PVD，PVD的发生率为83.3%。B、C两组实验眼出现PVD的阳性发生率与A组比较有显著性差别 (拟然比χ2=8.328,P =0.04,P <0.05)。
2.2.2  透射电镜
   对照眼及A、B两组实验眼视网膜组织结构基本正常，各层细胞解剖结构清晰，各级神经元细胞胞膜及细胞核完整，未发现明显药物损害的表现。C、D两组实验眼视网膜神经节细胞水肿，细胞器肿胀。另外，双极细胞及光感受器细胞也出现水肿及变性改变。
2.2.3  生理检查
   对实验兔的实验眼和对照眼进行暗适应闪光ERG检测，结果表明对照眼术前b波振幅的平均值为219.36 37.87，术后为215.72 40.01 ，注药前后b波振幅无明显变化（t =0.280,P =0.781）。A、B两组实验眼术后b波振幅的平均值与术前比较无明显降低（P >0.05）；而C、D两组实验眼术后b波振幅较术前明显降低，差异有显著性（P <0.01）（Tab 2）。

3讨论
   玻璃体后脱离指玻璃体后界膜和视网膜内界膜表面的分离。玻璃体和视网膜之间的粘连对于视网膜脱离、增生性糖尿病视网膜病变等许多玻璃体视网膜疾病的发生、发展起关键的作用，而且在玻璃体切割术前诱导PVD可使手术难度降低，减少术中及术后并发症，对于预防术后PVR，改善视功能具有重要意义。目前国外开始药物性PVD的实验并进行了各种尝试性研究来促进玻璃体液化和解除玻璃体-视网膜间粘连。
   Tezel曾将Dispase蛋白酶注射至离体的猪眼玻璃体腔中，培养数分钟后诱发了完全性PVD。但该酶的研究还仅局限于尸体眼，而且对于Dispase蛋白酶对视网膜的毒性作用未进一步探讨。
在本研究中我们通过对兔眼玻璃体腔内注射Dispase蛋白酶观察该酶诱导PVD及对视网膜的毒性作用。在PVD的许多诊断方法中，扫描电镜由于能全方位精确观察玻璃体视网膜界面之间的粘连情况，区别完全与不完全PVD，阳性率较高。因此，可作为诊断PVD的最可靠最重要的指标。结果显示Dispase蛋白酶0.005U/0.1ml和0.0125U/0.1ml浓度组实验眼中各有4只眼发生完全性PVD，PVD的发生率为66.7%；0.025U/0.1ml浓度组实验眼中有5只眼发生完全性PVD，PVD的发生率为83.3%。而各组对照眼及A组（0.0025U/0.1ml）无PVD发生。因此，浓度为0.005U/0.1ml和更高浓度的Dispase蛋白酶可诱导产生完全性PVD(P <0.05)。原因在于Dispase蛋白酶是一个35.9KD非特异性胶原蛋白水解酶，作用于IV型胶原和纤维连接蛋白，使玻璃体的II型胶原和内界膜表面的IV型胶原、纤维连接蛋白彻底水解，松解玻璃体后界膜和内界膜之间的粘连，从而诱发PVD。
   视网膜毒性的检测结果是实验用药的重要指标。对于Dispase蛋白酶的安全性我们观察到多数实验眼注药后均出现前房渗出及玻璃体混浊。但随着时间的延长，前房及玻璃体反应基本消失。高浓度组则出现视网膜浅层出血而且0.025U/0.1ml浓度组有一只兔眼发生晶体混浊。可能是由于高浓度的Dispase蛋白酶作用于晶体囊膜的IV型胶原和视网膜血管周围基质的主要成分纤维连接蛋白所致。另外，ERG从细胞水平来评价视觉功能，综合反映视网膜功能，b波反映了视网膜双极细胞和Müller细胞的电活动，可反映视网膜的功能状态[6]。在本实验中，我们选用暗适应ERG最大反应b波振幅及透射电镜作为视网膜功能和形态观测的指标。结果显示0.0025U/0.1ml和0.005U/0.1ml两浓度组对视网膜不产生功能上的影响（P >0.05）且视网膜组织结构基本正常；而更高浓度的Dispase蛋白酶术后ERG b波振幅较术前明显降低（P <0.01），透射电镜检查视网膜神经节细胞、光感受器细胞水肿，细胞器肿胀及变性改变等视网膜毒性反应。所以，高浓度的Dispase蛋白酶对视网膜产生明显的毒性作用。
   根据本实验结果，我们认为Dispase蛋白酶可有效的诱导PVD，低浓度0.005U/0.1ml 的Dispase蛋白酶不但能有效的诱发完全性PVD且对视网膜无明显的毒性作用。高浓度的Dispase蛋白酶虽然可迅速有效的诱导产生完全性PVD，但对视网膜产生明显的毒性作用。因此，该药应用于临床还需进一步实验研究，在药物浓度方面应慎重考虑。

基金项目：陕西省自然科学研究基金资助（200C280）
作者单位：710004 西安， 西安市第四医院眼科
通讯作者：黄玲 Tel. (029) 82202916   Email. huanglingmd @yahoo.com.cn