银染核仁组成区(silver staining of nucleolar organizer region, AgNOR)染色已广泛应用于鉴别良、恶性肿瘤的研究。我们在进行动物实验的同时，试图将AgNOR染色应用于正常眼组织、激光屈光性角膜切削术(PRK)后角膜组织及小梁切除术滤过区组织的研究中，观察其染色效果和意义，现将其报告如下。 1　材料与方法 　　1.1　实验动物和分组　选取成年健康新西兰白兔6只，体重2.5～3.0kg，雌雄兼用(由本院实验动物中心提供)。其中对照组2只(4眼)，PRK组2只(4眼)，小梁切除术组2只(4眼)。 　　1.2　动物模型制作 　　1.2.1　PRK模型制作　戊巴比妥钠(质量分数为0.03)将兔耳缘静脉麻醉(剂量1.2mL．kg-1)，Dicaine(质量分数为0.01)表面麻醉。按常规方法将兔双眼行PRK，输入-8.0D切削程序，切削深度150μm，消融直接5.6mm。使用激光器为Chiron Vision 117-C型(USA)，能量为1 200J．m-2，频率50Hz。术后饲养4wk用于实验。 　　1.2.2　小梁切除术模型　将兔耳缘静脉麻醉后，手术显微镜下行双眼小梁切除术，做以穹隆部为基底结膜瓣，5mm×5mm巩膜瓣，深达1/3巩膜厚度。在角巩膜缘交界处切除1.5mm×3mm小梁组织，未行虹膜周切，缝合巩膜瓣上角各1针，密闭缝合结膜瓣。术毕结膜下注射庆大霉素地塞米松0.2mL。术后饲养2wk用于实验。 　　1.3　标本制作　将兔空气栓塞致死，摘出眼球(小梁切除组勿伤及滤过泡区结膜)。对照眼眼球一分为二，PRK组取下完整角膜并一分为二，小梁切除组取滤过泡区全层眼球壁。立即加入多聚甲醛液(质量分数为0.04)固定24h以上，按常规方法脱水、透明、包埋和切片。 　　1.4　AgNOR染色液配制　甲液：明胶粉2g溶于双蒸水中至99mL，然后加入1mL纯甲酸摇匀，室温放置。乙液：硝酸银50g溶于双蒸水至100mL，充分溶解后4℃避光保存。工作液：甲液10mL，乙液20mL，置立式染色缸中混匀后立即使用。 　　1.5　染色方法及观察　将切片双蒸水洗2次，入AgNOR工作液中暗处浸染25～30min，双蒸水洗3次，无水乙醇洗2次，入二甲苯：石碳酸(4∶1) 1min，二甲苯透明，国产中性树胶封固。光镜下观察组织结构形态和细胞核内黑色银染颗粒情况。 ----- 2　结果 　　2.1　AgNOR染色情况　光镜下可见细胞浆和细胞外组织被染成浅黄色，细胞核染成棕黄色，边界清晰，核内可见分散的1个或多个AgNOR小黑点，有时许多细小颗粒集合或融合成不规则团块状。 　　2.2　眼组织AgNOR染色　正常兔眼角膜可见3～4层上皮细胞，底层柱状细胞银染颗粒明显，可达2～3个(图1)，基质角膜细胞核染色明显，可见少数银染颗粒，后弹力层染成棕色，内皮细胞呈单层，可见1～2个银染颗粒；PRK后切削区角膜上皮层增厚，前基质内角膜细胞数增加，上皮细胞AgNOR染色增强，可见3～6个银染颗粒(图2)。结膜和筋膜组织分界明显，上皮细胞银染颗粒可达3～4个。眼外肌横纹染色清楚，肌细胞可见1～3个银染颗粒(图3)。巩膜纤维走行规则，成纤维细胞少，细胞核染色明显，有1～3个银染颗粒；小梁切除后滤过泡区瘢痕化，巩膜表面成纤维细胞增多，可见纤维结缔组织增生，AgNOR染色明显增强，可见3～7个银染颗粒(图4)。脉络膜呈疏松网状，细胞核中可见少数银染颗粒。睫状突可见2～3层上皮细胞，可见1～3个银染颗粒(图5)。视网膜染色清晰，各层结构分辨明显(图6)。 　　　　　　　　　　   　　　　　　正常角膜上皮细胞核中可见2～3个AgNOR颗粒(20×) 　　　　　　　　　　　 　　　　PRK后4wk，角膜上皮细胞核中可见3～6个AgNOR颗粒(20×) 　　　　　　　　　　 　　　　　　　　　　正常眼外肌横纹染色清楚(20×) 　　　　　　　　　　    　　小梁切除术后2wk，巩膜成纤维细胞可见3～7个AgNOR颗粒(20×) 　　　　　　　　　　 　　　　　　正常睫状突上皮细胞可见1～3个AgNOR颗粒(20×)        　　　　　　　 　　　　　　　　　　正常视网膜结构染色清晰(20×) ----- 3　讨论 　　3.1　AgNOR的染色原理　AgNOR由核仁中嗜银性非组蛋白构成，与核糖体(rDNA)的形成及细胞内蛋白质的合成关系密切，它还可转录rRNA，故可以用来反映核仁结构和功能改变。非组蛋白中的羧基键还原银溶液而形成银的微小核心，然后这些微核发展成较大的银聚合物，而沉积于胱氨酸、半胱氨酸的双硫键及硫氢键的位置上，这些较大的沉积物在光镜下清楚可见到核仁组成区的嗜银蛋白［1］。细胞增殖异常活跃导致许多细胞内核仁分解，AgNOR颗粒分散于细胞核内，因此银染颗粒的多少可反映细胞的增殖活性状态。 　　3.2　眼组织AgNOR染色及其意义　AgNOR染色主要用于肿瘤学，多以其数量、大小或着色强弱及随体联合频率为指标，研究其rRNA的位置和活性改变，达到鉴别良、恶性肿瘤及细胞增生类型的目的［2,3］。银染颗粒数目能反映细胞功能状态，也能反映rDNA量值的变化，这对研究细胞rRNA基因转录活性有一定意义。随着分子生物学技术发展，真核细胞基因研究取得了不少成就，但由于其需要昂贵的试剂和设备，非一般实验室能为之。AgNOR方法简单易行，为从基因水平调控细胞功能状态提供了力所能及的研究辅助方法。 　　本研究对部分眼组织进行AgNOR染色，发现组织结构染色清楚，能清晰地观察到细胞核中AgNOR颗粒，能较好反映细胞增殖活动状态。目前已证实PRK后早期角膜上皮层增厚，前基质角膜细胞增多，且能导致临床haze的发生［4,5］。AgNOR染色结果与此相符，且发现PRK后前基质角膜细胞核内银染颗粒增多，表明角膜细胞增生活跃。小梁切除术常由滤过泡瘢痕化而导致手术失败，正常兔眼小梁切除术后2wk可见滤过泡区广泛纤维化，滤过功能消失［6］。AgNOR染色能清楚地显示滤过区纤维增生，成纤维细胞核内银染颗粒多，能较直观的反应细胞增殖活性。AgNOR染色简单易行，为眼组织细胞增殖活性状态的研究提供了可选用的方法。