80年代以来，人们对细胞凋亡这一现象进行了广泛深入的研究，在RB的研究中，相继有报道RB存在细胞凋亡 ［1-3］，但在RB细胞凋亡是否为RB细胞死亡的主要形式上尚存争议。临床上，RB及少数可以自然消退，在这些自然消退的肿瘤中，凋亡究竟起到怎样的作用尚无定论。本文通过17例人RB标本中细胞凋亡的观察，探讨细胞凋亡在RB发生发展及消退中的作用。 1　材料和方法 　　1.1　材料　标本来源：17例RB标本来自1968～1997年上海医科大学附属眼耳鼻喉科医院眼科病理室保存的手术摘除眼球石蜡包埋标本。其中有2例在手术摘除后立即剖开眼球，取出部分瘤组织用于电镜检查。17例中有分化型7例，未分化型8例，自发退化型2例;程序性细胞死亡检测试剂盒：洛阳华美生物工程公司产品，－20℃保存。 1.2　实验方法　(1)光镜切片制作：每例石蜡标本重新切片，厚度为5μm(6张)，其中3张用作HE染色，另3张切片中取1～2张用作原位DNA断端标记（TUNEL方法）；(2) 电镜切片制作：17例RB中有2例手术摘除眼球后即剖开，取新鲜肿瘤组织5块，每块2mm×2mm×2mm ，超薄切片后，醋酸铀及枸橼酸铅双重染色，JEM-1200EX型透射电镜下观察、拍片。自发退化石蜡标本2例，切片厚20μm，脱蜡后，超薄切片及染色后电镜观察、拍片；(3) TUNEL方法DNA断端标记：切片常规脱腊，以过氧化氢消除内源性过氧化物酶活性，用末端脱氧核苷酸转移酶（terminal deoxynucleotidyl transferase， TDT）介导生物素化的尿苷三磷酸(biotin-dutp)与DNA断端结合。信号以抗生物素蛋白放大，并以二甲氨基偶氮苯显色，苏木素复染。光镜辨认被标记的细胞核。阴性对照：除省略加入TDT酶之外，其余步骤同前。 2　结果 　　2.1　光镜下HE染色与TUNEL标记染色对照结果　光镜下HE染色见：瘤细胞呈小圆形、胞浆少、核大而深染。在15例分化型与未分化型标本中，TUNEL染色阳性有9例（60％），另有6例TUNEL染色阴性，其中分化型例，未分化型3例。将每例标本光镜下HE切片与TUNEL切片作对照观察：TUNEL染色阳性区分布：（1）散在于活细胞中(图1)；(2)在仅存细胞轮廓、HE染色下大片染成淡红色的细胞间大量出现(图2)；(3)自发退化标本HE染色光镜下表现为瘤细胞极少有活细胞，大部分细胞仅见细胞轮廓，核褪色，染色成一片淡红色或仅见稀疏的嗜碱性碎片，大量纤维增生，色素沉着，并有钙化形成。TUNEL方法染色观察2例中1例染色阴性，另1例见成片着色(图3)。 方法染色，可见散在的染成棕色的细胞(×400)。 方法染色，见成片染成棕的细胞(×400) 自发退化标本TUNEL方法染色， 示细胞均被染成淡棕色(×400)。 ----- 　　2.2　电镜观察结果　(1) 2例新鲜标本取材后电镜观察（分化型、未分化型各1例），RB细胞中存在2种细胞死亡形式，即坏死和凋亡。凋亡细胞的分布：在活细胞中散在、零星出现，量少。形态特征：细胞收缩变小、胞膜完整、胞浆浓缩，细胞器如线粒体仍可见，核固缩或呈星月形向两极聚集，最后形成由细胞膜包绕的凋亡小体(图4)；坏死的分布：成堆出现，数量远较凋亡为多，坏死细胞中未见凋亡细胞或凋亡小体。坏死的形态特征：胞浆肿胀、胞膜破裂、细胞内容物溢出散在于细胞之间；(2) 2例自发退化石蜡标本电镜观察：细胞结构破坏，核染色质大部分消失，细胞膜不完整，未见细胞凋亡小体。 电镜下见凋亡细胞，核固缩，呈星月形，向两极聚集(×4 000) 　　3　讨论 　　3.1　RB细胞死亡通过坏死与凋亡2种方式。细胞凋亡的观察最初是从超微结构开始的，就目前来讲，超微结构的特征也仍然是诊断凋亡的可靠标准［4］。我们通过电镜观察确实发现RB细胞凋亡存在，从数量上看，坏死细胞远多于凋亡细胞，与Büchi等［2］的结果一致。TUNEL标记法是从分子水平检测细胞凋亡的方法，自从1992年Gavrieli等［5］首先报道以来被广泛应用。从我们的实验中看出，TUNEL方法在部分标本中呈阳性反应。但TUNEL方法标记阳性细胞的分布与电镜观察所见有差异。TUNEL阳性细胞除散在分布于活细胞之间外（这与电镜观察凋亡细胞分布一致），还大量见于HE染色中细胞核染色质褪色，细胞仅存轮廓，均匀染成淡红的区域，电镜下这一区域细胞胞膜不完整，核染色质碎裂、溢出，为坏死区，未见凋亡小体。因此，我们考虑这一区域中TUNEL阳性为假阳性结果。经典的研究认为细胞凋亡是散在的、单个出现的［4］，但近年来用TUNEL方法研究肿瘤组织细胞凋亡，有多篇报道TUNEL(+)成片出现，对此，解释不一，Ikeda等［6］认为是细胞凋亡，但缺少电镜资料。Bettina等［7］用典型的细胞凋亡及细胞坏死模型经TUNEL方法染色证实，2种模型细胞均可为TUNEL方法染色，Yasuda等［8］研究子宫内膜及胎盘绒毛细胞凋亡时发现，具有明显水肿变性的胎盘绒毛存在大片TUNEL(+)区，因此，认为TUNEL(+)成片出现为假阳性。目前多数学者认为，TUNEL方法可以直观地表达细胞凋亡，但其特异性还有待提高，尤其是在用作肿瘤病理分析时应慎重。事先避免缺血、坏死区。我们认为，观察细胞凋亡不能仅仅看TUNEL染色一个指标，应与组织形态学密切结合。结合光镜、电镜及TUNEL标记我们认为：RB细胞死亡存在凋亡与坏死2种方式，从数量上来讲以坏死为多。 ----- 　　3.2　自发退化　RB中细胞凋亡所起的作用：RB自发退化发生率在1%～2%［9］。我国李彬等［10］报告占4.58%,我院1955～1997年共有7例，占0.6%.临床上常表现为：自发退化前有视网膜母细胞瘤常见的症状、体征。如白瞳症、眼红痛等继发青光眼的表现，以后眼球逐渐萎缩。目前有关其自发退化的原因尚不清楚 ，曾认为某些抗肿瘤抗体的产生致使肿瘤消退或由循环中毒性物质或高钙引起，但有人观察到在双眼RB患者中，一眼RB迅速发展侵犯眼外，而另一眼则自发消退（我院也曾有1例），因此，对上述理论又提出怀疑。也有人观察到退化的RB有视网膜中央动脉阻塞，但阻塞发生于细胞死亡之前还是细胞死亡之后还不清楚。毛健等［3］观察17例自发退化的RB，发现HE切片中细胞褪色区出现大片TUNEL阳性细胞,同时测量该区域内肿瘤细胞DNA倍体数，在测量的细胞中DNA出现低于二倍体的峰值。这一峰值曾被认为是诊断凋亡的可靠指标。因此得出细胞凋亡导致RB 自发退化的结论。但目前研究认为，坏死晚期细胞DNA链可出现随机断裂，DNA断裂、DNA降解同样也可出现该峰值。因此凋亡与坏死无法用这一指标区分［11，12］。从我们的实验中见:光镜下2例自发退化RB均表现为瘤细胞极少有活细胞、大部分细胞仅见细胞轮廓，核褪色，细胞染成淡红色一片或仅见稀疏的嗜碱性碎片，并伴有大量纤维增生、色素增生、钙化形成。电镜下未见凋亡小体，但可见细胞结构破坏、胞膜破裂，TUNEL标记1例为阴性,另1例可见细胞大片着染呈淡棕色，结合HE切片中细胞形态特征，我们认为这是大片细胞坏死而不是细胞凋亡。因此，我们未能找到细胞凋亡导致RB自发退化的直接证据。 　　　　　　　　　　　　　　　　　　文章来源：眼科新进展