(一)免疫学检测
1．一般检测
(1)血细胞计数及分类：感染免疫性疾病可引起血白细胞数增多，尤其是中性粒细胞增多；系统性红斑狼疮及免疫缺陷病者其中性粒细胞减少；嗜酸性粒细胞增多时，应考虑过敏性或特应性疾病。
(2)血小板计数：原发性免疫缺陷病常伴有血小板减少。器官移植排斥反应可出现血小板减少。
(3)红细沉降率(血沉、ESR)：风湿、类风湿、自身免疫性疾病患者的血沉可加快。
(4)血钙测定：原发性免疫缺陷病常伴有低血钙。
(5)血型鉴定：某些免疫遗传性眼病可能与血型抗原有关，如原发性青光眼、老年性白内障等与血型相关。
(6)皮内试验：利用已知抗原或抗体行前臂内侧皮内注射，如体内存在特异性抗体或抗原，或致敏淋巴细胞即可发生免疫反应，局部皮肤红肿，或诱发全身症状。此属特异性免疫诊断方法。晶状体、角膜及视网膜抗原等均可作为诊断抗原。
(7)病理组织学检查：此为一种常规的病理学检查法，所有能获得病理组织的眼免疫病均可行组织病理学检查。常规的组织病理学检查步骤包括组织固定、石蜡或火棉胶包埋、脱蜡、染色等。
组织病理学检查对某些眼免疫病的诊断具有重要意义，如蚕蚀性角膜溃疡病变角膜和结膜组织中有淋巴细胞、中性白细胞、肥大细胞浸润等。交感性眼炎具有典型的病理组织学改变：淋巴细胞、浆细胞、单核细胞及类上皮细胞浸润，从而使脉络膜明显增厚。
2．体液免疫测定
病原微生物侵袭机体，刺激机体产生抗体，当抗原再次侵人机体，与相应抗体结合时，便可活化免疫细胞或释放免疫活性介质，产生溶菌、杀菌、中和病毒等功能，这就是机体产生的体液免疫功能。而在体外(玻片、试管)，抗原与相应抗体结合时，便可出现凝集、沉淀等可见反应。因此，可用已知抗原检测体内未知抗体，或用已知抗体检测未知抗原，这些体液免疫检测将有助于某些免疫性眼病的诊断和鉴别诊断。
(1)抗原的制备：抗原分生物和非生物性抗原，一般要求由国家指定的生物制品单位统一供应，有条件的可自制，但必须经过严格的鉴定，保证质量。直接在人体注射检测者，一定要严格无菌操作，抗原效价要高，以避免假阴性和假阳性结果出现。临床上常用的抗原有晶状体抗原、视网膜抗原、脉络膜抗原、角膜抗原等生物性抗原。角膜可溶性抗原包括角膜上皮、基质及内皮抗原，可用甘氨酸法提取。此外尚有花粉、室内尘埃、塑料等非生物性抗原。
(2)抗体制备：制备血清或眼液抗体，要防止蛋白变性，力求新鲜，防止细菌污染。为了定量检测抗体，一般要做适当稀释。稀释的方法有多种。如几何级数法、算术级数法等。血清抗体制备较易，标本采集过程中的影响因素较少。泪液抗体制备常受各种因素影响，如泪液采集方法不同致使各家报道的结果不同。泪液采集方法包括棉珠吸取法、海绵吸取法、针头抽吸法、毛细管法、滤纸条法等。由于泪液量较少，采集时常用直接或间接刺激法以增加泪液分泌量，这样势必影响泪液的质量及抗体浓度。有学者比较了刺激与未刺激泪液免疫球蛋白含量的相关性：IgG呈中度相关，IgA呈高度相关。房水抗体制备常因房水量少不易采集而受限。而且采集时要求严格无菌操作，动作要稳准，避免损伤虹膜、晶状体等组织。
(3)常用检测法
凝集反应：是指某些颗粒性抗原(如细菌、细胞、胶乳微粒等)与相应的抗体结合，在合适电解质存在时，便出现可见凝集小块。凝集反应分直接和间接凝集反应。
沉淀反应：是指可溶性抗原(如细菌浸出液或培养液、组织渗出液等)与相应抗体结合，在某些电解质存在下便形成肉眼可见之沉淀物。包括环状沉淀、絮状沉淀反应及琼脂扩散试验等。
溶菌反应：抗原抗体结合，在补体参与下可出现溶菌反应。
免疫黏附血凝：抗原抗体结合形成免疫复合物，结合补体后形成抗原抗体补体复合物，再加含有补体受体的红细胞，便出现细胞凝集现象。
免疫荧光抗体法：将荧光素标记于抗体上，抗原抗体结合后，在荧光显微镜下便呈现荧光抗原抗体复合物。临床上常用于病原体的快速诊断。如单纯疱疹病毒性角膜炎试剂盒即属此类。
放射免疫法：指用放射性同位素(如协I或b。I)标记抗原或抗体，抗原抗体结合后可用放射自显影及竞争性免疫法测定抗体或抗体的存在。该法灵敏，可测出微量抗原或抗体。
用酶来标记抗体：该酶与底物发生化学反应，产生有颜色的沉淀物质，光镜或电镜下可观察。
用电子致密物质标记抗体：抗原抗体结合后电镜下观察可甩以病毒、细菌等病原生物直观检查。
(4)临床应用
免疫球蛋白测定：免疫球蛋白(Ig)是机体受抗原刺激而产生的抗体。包括IgG、IgA、IgM、IgE、IgD等。一般认为Ig增高可能由感染性疾病、某些过敏性眼病、结缔组织病、免疫增殖病等引起。降低则见于免疫缺陷病。如单纯疱疹病毒性角膜炎患者}目液中IgA低下，说明局部抵抗力降低，易患病，易复发。春季性结、角膜炎泪液IgE明显增多。
抗原抗体检测：利用琼脂扩散、免疫电泳法、免疫荧光法、放射免疫测定法、免疫酶染色法等均可进行异性抗原抗体检测。如用已知的抗体检测单纯疱疹病毒、沙眼衣原体、眼寄生虫等抗原，亦可检出蚕蚀性角膜炎溃疡患者的自身抗原。
免疫复合物测定：抗原抗体复合物或抗原抗体补体复合物的血清浓度增加或组织沉积是某些角膜病的特征性病理改变。用沉淀法和免疫荧光技术均可检测。如蚕蚀性角膜溃疡患者的循环免疫复合物增加，近角膜溃疡和球结膜处有IgG、IgM及C3沉积。
3．细胞免疫测定
(1)白细胞免疫测定
自细胞计数及分类：注意中性细胞及嗜酸粒细胞总数。细菌感染性疾病中性粒细胞增加；过敏性疾病嗜酸粒细胞增加。
白细胞移动抑制试验：分直接和间接法，常用移动指数表示：
移动指数=加入抗原时白细胞移动面积/不加抗原时白细胞移动面积
正常值在0.8以上，复发性单疱病毒性角膜炎其白细胞移动指数低于正常。
(2)巨噬细胞功能测定：巨噬细胞具有吞噬功能，计算其吞噬百分比可了解其吞噬功能强弱。免疫缺陷病患者的吞噬百分比降低。
(3)淋巴细胞免疫功能测定
E一玫瑰花结试验：包括T花环和B花环试验。前者是指结合有绵羊红细胞且形成玫瑰花样的T淋巴细胞百分率；后者是指能结合绵羊红细胞并形成花结的B淋巴细胞百分率。细胞免疫缺陷时，T花环形成率降低；如单疱病毒性角膜炎患者的T花环形成率明显低于正常人。同理，体液免疫缺陷时，B花环形成百分率降低。
淋巴细胞转化试验：是指T淋巴细胞在体外受抗原物质刺激后能转化为淋巴母细胞，其转化率为70％左右(外周血)。复发性单纯疱疹病毒性角膜炎患者的淋巴细胞转化率常低于正常。
淋巴细胞亚群测定：应用OKT系列单克隆抗体，以间接免疫荧光法测定外周血T细 胞亚群，对于探讨某些眼病的免疫机制和指导临床具有重要意义。有报道指出活动期单 纯疱疹病毒性角膜炎患者外周血OKT8细胞升高，OKT4细胞下降，O＆／T8比值下降或倒置。说明机体处于免疫抑制和免疫调节紊乱状态。
淋巴毒素测定：淋巴细胞所产生的淋巴毒素具有杀伤靶细胞的作用。淋巴毒素的测定有助于了解机体特异性细胞免疫功能状态及疾病预后。
淋巴结组织学检查：淋巴结由皮质和髓质两部分组成，皮质又分浅皮质区和深皮质区。浅皮质区含有淋巴小结，小结中央为生发中心，多为B细胞。深皮质区主要为T细胞，约占淋巴结的75％。若皮质浅层发育不良，生发中心未形成，则为体液免疫缺陷。皮质深层发育不良，T细胞缺乏，表示细胞免疫缺陷。此外，淋巴结活检还可行淋巴细胞亚群分类及功能检测。
(4)红细胞免疫功能检测：红细胞具有识别和储存抗原的能力，并可通过免疫粘附作用清除循环免疫复合物。
红细胞免疫黏附试验：将2％人红细胞悬液与2％绵羊红细胞悬液混合，室温下孵育20分钟，镜检算出与绵羊红细胞形成玫瑰花环的百分率。
红细胞C3b受体花环试验：将用生理盐水洗涤3次的1．25×107／ml红细胞悬液与被C3b致敏的1×108／ml酵母菌液混匀、37~C水浴30分钟，固定、涂片、染色、镜检，算出花环率。正常人为12．8±5．35％。葡萄膜炎炎症期的红细胞C3b受体花环率明显下降。
红细胞免疫复合物花环试验：将未洗涤的1．25×107／ml红细胞悬液与非致敏酵母菌悬液(1×108／m1)混匀，水浴30分钟涂片计算花环率。笔者检测的87例献血员，红细胞免疫复合物花环率平均值为5．20±1．15％。蚕蚀性角膜溃疡患者比值常升高。葡萄膜炎炎症期血中免疫复合物明显增加。
(5)单克隆抗体临床应用：近年来已有多种单克隆抗体用于角膜病的诊断，其优点在于快速、准确、特异性高。如单疱病毒单克隆抗体可用于单疱角膜炎的快速诊断。T细胞亚群单克隆抗体用于T细胞亚群细胞计数，指导角膜移植。角膜蛋白单克隆抗体可检查恶性肿瘤。
4．分子生物学检测
(1)原位杂交技术：原位杂交技术是利用标记的DNA或RNA为探针，在原位检测组织细胞内特定核酸序列的方法。根据所用探针和靶核酸的不同，原位杂交可分为DNA—DNA杂交，DNA=RNA杂交。又根据探针的标记物是否能直接被检测，可分为直接和间接原位杂交法。前者主要用某些酶、同位素、荧光等标记的探针与靶核酸进行杂交，杂交后分别通过酶促反应、放射自显影、荧光显微镜等直接显示和观察。后者则一般采用半抗原标记探针，最终通过放免组织化学法对半抗原定位，间接地显示探针靶核酸形成的杂交体。
杂交反应时应注意载玻片加热、探针加热、杂交时间、杂交温度等；杂交后还应注意去除未参与杂交体形成的过剩的探针，除去探针与组织标本之间的非特异性结合，以减低背景，增加倍／噪比。处理时使用盐溶液的浓度、温度、洗涤时间等应根据核酸探针的类型和标记物的种类不同而不同，一般原则是盐溶液浓度由高蓼胝，而温度则由低到高。原位杂交技术主要用于单疱病毒性角膜炎、角膜变性、角膜营养不良、视网膜色素变性、视网膜母细胞瘤、急性前葡萄膜炎的辅助诊断和机理研究。
(2)聚合酶链反应：聚合酶链反应(Polymerase chain reaction，PCR)是一种体外核酸扩增系统，是一个在模板DNA、引物和四种脱氧核苷酸等存在情况下，DNA聚合酶依赖的酶促合成反应。本法具有快速(数小时)、灵敏(ng甚至坛级的靶DNA)、操作简便(自动化)等优点。
PCR的基本原理是利用DNA聚合酶具有以单链DNA为模板，寡聚核酸为引物，沿5-_3方向掺人单核苷酸的特性，在体外适宜条件下扩增DNA片段。扩增过程包括高温变性、低温退火和适温延伸。在短时间内可使被检测的微量DNA扩增到数百倍，易于被检出。
目前已广泛应用于眼科基础和临床研究，如沙眼、单疱性角膜炎、sjogren综合征、视网膜色素变性等的特异诊断。近年来，有学者利用PCR技术证实了培养的角膜内皮细胞能产生表皮生长因子(Epidermal Growth Factor,EGF)受体的mRNA、成纤维细胞生长因子(Fibroblast Growth Factor，FGF)和p-肌幼蛋白(Beta actin)mRNA。发现在老化细胞中EGF、mRN~．，白介素IJa(IL-La)mRNA及转化细胞生长f；．RNA减少，这可能是导致细胞转化的原因。Rakoczy等报道了应用PCR技术进行角膜HLA配型，通过选择I-ILA适配型可减少术后角膜移植排斥反应的发生。
(3)反义核苷酸：反义核苷酸是根据互补原理，利用人工合成(或生物合成)一类特定互补的DNA或RNA片(或其修饰物)，当互补片段处理mRNA或DNA时，互补碱基间发生氢链作用形成互补双链，从而抑制mRNA翻蛋白的过程，表现为对基因表达的封闭和抑制。
反义核苷酸特异性高，主要针对遗传突变基因或病毒的特异基因合成相应的反义DNA或RNA片段；加入体内能特异地封闭突变基因或病毒特异基因。
反义核苷酸在眼科疾病的应用主要集中在病毒性疾病的基因治疗上，用反义核苷酸可杀灭病毒，治愈疾病。故有研究复发性单疱病毒性角膜炎的实验报告，Kimura等在小鼠单疱病毒角膜炎(HSK)模型上，利用反义核苷酸治疗，使HSK明显抑制，角膜单疱病毒(HSV)阳性细胞明显减少。
(4)DNA序列测定：DNA的序列测定是分析基因的结构和功能的重要技术。其对眼免疫遗传病的诊断和治疗具有重要的意义。
目前应用的快速序列测定法有两种：①Sanger双脱氧终止法(酶法)；②化学降解法 (Maxam—Gibert法)。Sanger双脱氧终止法简便快捷，应用广泛。其原理是利用特异性引物与单链DNA模板相退火，在DNA聚合酶作用下进行延伸反应，并在双脱氧核苷三磷酸作用下进行碱基特异性的链终止，然后采用聚丙烯酰胺凝胶电泳区分长度相差一个核苷酸的单链DNA，从而完成测序反应。利用放射自显影技术正确读取DNA序列。
(5)克隆化基因的表达与蛋白产物的检测：目前对原核表达系统了解的比较深入，且应用广泛。原核生物的基因表达是以操纵子为单位，一个操纵子包括操纵基因和启动子。原核生物无核膜，其转录和翻译是同时进行的。原核基因不含内含子，故真核基因进入原核细胞表达时必须是已切除内含子的DNA片段。原核基因的控制主要有起始和终止控制(即启动子和衰减子控制)。大肠杆菌mRNA可以和多个核糖体结合。
利用上述特点，可以对外源基因的蛋白进行表达，主要通过融合和非融合两种方式。对外源基因进行诱导表达，然后采用异丙基硫代．J3一D．半乳糖苷(IPTG)法、SDS-聚丙烯酰
胺凝胶电泳技术、Western印迹法等以诱导和检测表达蛋白。
眼科某些免疫缺陷病、免疫遗传病等均可采用克隆化基因的表达与蛋白的产物的检测进行研究，以从基因工程角度探讨和控制疾病的发生、发展。
(6)化学发光免疫分析技术：化学发光免疫法(Iuminescent immunoassay，LIA)是继放射免疫法(RIA)和酶免疫法(En)之后的又一种微量免疫分析技术。由于发光标记物的不同，分为化学发光免疫分析(cLIA)和生物发光免疫分析(BLIA)。
LIA具有以下优点：①灵敏度高：最小检出值达到10～15mmol／L。灵敏度高于EIA和FIA，有人认为比EIA高1 000倍。②标记物稳定：一20℃可保存半年到一年。③检测程序简便快速。④应用范围广、检测效果好：目前已广泛应用于各种半抗原、抗原和抗体的检测，包括激素、蛋白质、多肽、酶、脂肪酸、维生素等生物活性物质。
根据其采用发光物质来标记活性的抗原或抗体，免疫复合物中含有发光能力成分便可测定抗体的含量；亦可利用抗原、抗体免疫反应过程中所产生物质建立CLIA法。通过记录和描绘发光的速度和强度，从而实现定量测定。
抗原、抗体的定量检测对某些免疫性眼病的诊断和指导治疗具有重要的意义。
(二)免疫性眼病的诊断原则
1．过敏性眼病
过敏性眼病包括过敏性眼睑炎、泡性结膜炎、春季性结膜炎、变态反应性角膜炎、Terrien’s边缘部角膜变性等，该类疾病的诊断原则如下：
(1)病史：询问有否特应性过敏性疾病的家族史及个人病史，接触过敏原史。
(2)血清IgE测定。
(3)血细胞检查：嗜酸粒细胞计数及脱颗粒试验。
(4)泪液IgE测定。
(5)刮片：嗜酸性粒细胞计数。
(6)皮肤试验。
(7)试验治疗。
2．自身免疫性眼病
与自身免疫有关的眼病有蚕蚀性角膜溃疡、干燥性结角膜炎、角膜融解综合征、圆盘状狼疮性角膜炎、角膜碱性烧伤葡萄膜炎、原发性青光眼等。其免疫诊断原则如下：
(1)病史：疾病自发，慢行迁延，反复发作，有遗传倾向，常与其他自身免疫病同时或交叉发生。
(2)测定特异性自身抗体。
(3)血清和泪液免疫球蛋白升高。
(4)循环免疫复合物增多，局部免疫复合物沉积。
(5)淋巴细胞计数及其功能测定。
(6)红细胞花环试验。
(7)单克隆抗体应用。
(8)皮肤试验。
(9)免疫抑制剂有显效。
(10)某些疾病与I-ILA有关。
3．感染免疫性眼病
单纯庖疹病毒性角膜炎、带状疱疹性角膜炎、牛痘性角膜炎、Thygeson’s表层点状角膜炎、流行性边缘性角膜炎、角膜基质炎、流行性角结膜炎、感染性结晶性角膜病变、真菌性角膜炎、棘阿米巴角膜炎、细菌性眼内炎等属于感染性眼病，其诊断原则为：
(1)病史：应询问外伤、手术及热病史，或戴接触镜史。
(2)血清及泪液免疫球蛋白测定。
(3)免疫荧光抗体染色。
(4)免疫酶染色技术。
(5)放射免疫法。
(6)单克隆抗体的应用。
(7)角膜刮片检查。
4．眼免疫缺陷病
免疫诊断原则：
(1)反复发作的病毒或细菌感染。
(2)免疫球蛋白降低或缺乏。
(3)补体降低或缺乏。
(4)末梢血中淋巴细胞计数低于正常。
(5)胸腺及淋巴结胸腺依赖区发育不良。
(6)T细胞亚群检测。
(7)淋巴细胞测定：包括B细胞和T细胞功能测定。前者主要有血清抗体降低，找不到血清抗体，淋巴结活检浆细胞计数减少或缺如。后者有末梢血淋巴细胞计数减少，淋巴细胞转化率降低，玫瑰花结形成率降低，白细胞移动指数下降等。
5．眼肿瘤免疫诊断
常见的眼部肿瘤有角膜鳞状细胞癌、恶性黑色素瘤、原位癌、视网膜母细胞瘤、脉络膜黑色素瘤等。
(1)检测肿瘤抗原及相关抗原。
(2)特异性抗肿瘤抗体测定。
(3)细胞毒抗体测定。
(4)细胞毒试验。
(5)特异性免疫试验：用提取的肿瘤抗原做淋巴细胞转化试验、玫瑰花结试验等。
6．角膜移植免疫学诊断
免疫排斥反应是导致角膜移植失败的主要原因之一，故做好角膜移植免疫学检测十分有助于角膜移植排斥反应的早期诊断和治疗。
(1)了解术前组织配型(ABO及HLA配型)、淋巴细胞转化率等。相配性愈低，转化率愈高，愈易发生排斥反应。
(2)淋巴细胞及功能检测，如T细胞总数、淋巴细胞转化率及白细胞移动指数较术前值为高，说明排斥反应已发生。
(3)血清总补体及C3补体下降，提示有发生免疫排斥反应的可能。
(4)血小板检测术后血小板减少，而白细胞不降，提示有排斥反应发生。
来源:何守志<临床眼科学>
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