玻璃酸（hyaluronic acid，HA）是一种酸性黏多糖，存在于人体关节等部位。卡波姆（carbomer）是聚丙烯酸交联聚合物。两者均属预制型凝胶类，被广泛用作人工泪液，用于治疗干眼综合征。由于大多数滴眼剂需频繁使用，则在其中加入防腐剂，最为常用的是苯扎氯铵（benzalkonium chloride，BAC）。有研究表明BAC可瓦解泪液膜并损伤上皮细胞。在动物和人体上进行的研究表明防腐剂很容易造成眼表面损伤，从而被怀疑可导致对滴眼剂局部应用耐受性的损害。
   本实验目的是确定卡波姆934P和HA是否会与BAC作用，从而降低这种四价阳离子表面活性剂对结膜上皮细胞的毒性作用，以及检测HA是否优于卡波姆，评估HA和卡波姆934P 的抗氧化活性。实验采用人连续性结膜细胞株，以冷光细胞荧光测定法评价细胞活性、DNA凝集及细胞活性氧（ROS）生成，用共聚焦显微镜评估细胞形态内容。

   1 材料与方法
   1.1 结膜细胞株
   人结膜细胞株（Wong Kilbourne 衍生自Chang氏结膜，1-5c-4克隆，CCL-20.2；美式培养标本[ATCC], Manassas, VA）在标准条件下（经加湿的含5%CO2环境，37℃）的Dulbecco抯最低限度培养基（DMEM）中补充加10%胎牛血清、1%谷氨酰胺、0.1%氨苄西林、2%卡那霉素配置的培养基中培养。标准培养发育以相差显微镜检查进行评价。以温和的胰蛋白酶孵育移出培养细胞并计数。细胞接种至96孔板后进行微量滴定分析（每孔5000细胞）。亚融合达到后（培养表面覆盖接近70%）后加入不同的组分进行实验。
   1.2 细胞处理
   对无防腐的玻璃酸（HA BACˉ）、防腐的玻璃酸(HA BAC+，含有0.005% BAC)、BAC、无防腐卡波姆934P（carbomer 934P BACˉ）和防腐的卡波姆934P（carbomer 934P BAC+， 含有0.005% BAC）进行了实验。这5种药物在其商品浓度下（无防腐、防腐玻璃酸0.18%，BAC 0.005%，无防腐、防腐卡波姆934P 0.3%）及其在培养基上1:10稀释后进行实验。以培养基作为阴性对照。
   在本实验中，对实验组和对照组都采用了两个实验时间：15 min、15 min加24 h细胞恢复期。

   2 实验步骤
   2.1 多孔板冷光细胞荧光测定法 
   实验采用多孔板冷光细胞荧光测定法（Fluorolite 1000 Dynex Thermaobioanalysis多孔板荧光测定仪）根据欧洲替代方法验证中心（ECVAM）推荐采用的方法以及经验证的用于Chang氏细胞系的方法，测定3种细胞指标：细胞活性，细胞增生和ROS生成。
   2.2 细胞活性检测 
   细胞活性以荧光检测器（激发波长535 nm；发射波长600 nm）进行中性红实验。在细胞经不同药物处理后加入浓度为50靏/ml的中性红（neutral red）试液。
   2.3 染色质凝聚检测
   烟酸己可碱33342（Hoechst 33342）是一种增补染料，可测定总染色质量的变化以及染色质凝聚度。其特异性的与DNA中的腺嘌呤和脱氧胸腺嘧啶苷反应。这种探针可以在最终浓度为10靏/ml时用于细胞（激发波长360 nm；发射波长450 nm）。烟酸己可碱溶液中加入0.5 mg/ml 碘化丙啶以控制坏死细胞（这种DNA探针通过嵌入作用发生应答作用并且可以屏蔽烟酸烟酸己可碱对坏死细胞引起的作用）。将体外离体细胞对烟酸己可碱33342吸收与碘化丙啶的排除相结合作为测定细胞凋亡的方法。
   2.4 ROS 测定法
   通过5mol/L氢化乙啡啶（HE）进行检测（激发波长485 nm；发射波长600 nm）。HE被氧化为具有荧光的乙啡啶阳离子并与核DNA结合，产生广泛的荧光增强。
   ROS的产生通过DCFH-DA（2’,7’二氯荧光素二乙酸酯）荧光染料进行检测，使用浓度为20mol/L（激发波长490 nm；发射波长535 nm）。荧光信号的强度和ROS的生成成正相关。
   2.5 统计分析
   在所有的实验中，在微孔中只单独加入染色液（并不加入细胞）以测定背景荧光强度，并据此推算所有的对照及实验微孔的荧光强度。
   微孔板冷光细胞荧光检测法的结果是以对照组百分率表示并得到荧光单位。以不加处理的包含细胞并含有完整的培养基微孔作为对照。每种药物的浓度都在6个微孔中测定，每个试验点重复进行3次。统计学比较采用显著性水平为0.05的Mann-Whitney检验。
   2.6 免疫细胞学
   同时采用标准免疫荧光检测法测定细胞形态变化。在载玻片(Laboratory-tek II chambered coverglass)上培养细胞，然后以各种试验水凝胶处理15 min。细胞以磷酸盐缓冲生理盐水（PBS）洗涤并在-20℃下加入95%乙醇固定10 min，之后加入荧光鬼笔环肽（200 U/ml）检测丝状肌动蛋白。经过30 min保温以PBS洗涤细胞。加入碘化丙啶标记细胞核后以共聚焦显微镜进行检测。

   3 结果
   3.1 细胞活性评价
  与对照组比较，在以一般浓度处理15 min后（图 1A），无防腐HA、防腐HA以及无防腐卡波姆934P没有改变细胞活性（平均荧光强度分别为对照组的105%、107%和93%，无显著性差异），然而防腐卡波姆934P和BAC则引起了严重的细胞损伤(分别为对照组的78%和21%，P=0.0149和P=0.0002)。无防腐组分没有发现显著性差异，但防腐HA的细胞毒性则显著弱于防腐卡波姆（P<0.0001）。1:10稀释情况下，对于无防腐和防腐的卡波姆934P都观察到了轻微的但是具有显著性的细胞活性提高（分别为对照组的123%和116%，P=0.0122和P=0.0392），无防腐HA、防腐HA和BAC对细胞活性没有明显影响（分别为对照组的104%、106%和95%，无显著性差异）。
   在24 h的细胞恢复期后（图2），观察到了一般浓度下无防腐和防腐的卡波姆934P组的细胞活性的显著降低（平均荧光强度分别为对照组的65%和57%，P=0.0034和P=0.002，图2A），无防腐和防腐的HA组细胞活性没有显著性改变（分别为对照组的92%和94%，与对照组无显著性差异）。无防腐和防腐的HA引起的细胞毒性显著小于无防腐和防腐的卡波姆（与对照组比较P=0.0004）。在1:10稀释的情况下（图2B），无防腐和防腐的卡波姆934P以及无防腐和防腐的HA都没有改变细胞活性（分别为对照组的102、107%、94%和101%，无显著性差异），BAC则诱导了显著的细胞活性下降（为对照组的86%，P=0.04）。

 图1 处理15 min后细胞活性检测

   说明:在分别以卡波姆934P，玻璃酸，BAC处理15 min后进行细胞活性检测，DNA凝集，生成，H2O2生成实验。图的纵坐标为与对照组比较的荧光强度（%）。结果以占对照组的百分比表示（水平实线）。(A)一般浓度下的水凝胶检测结果 (B)水凝胶以及BAC在标准培养基中经1:10稀释后的检测结果。*P<0.05; **P<0.01, ***P<0.001（与对照组比较）。
   经过15 min实验处理或是在15 min处理后延长24 h的细胞恢复期（图1A, 2A），4种水凝胶在一般浓度下即便使用了相同浓度的防腐剂产生的细胞毒性都显著比单独使用BAC 时低（P<0.0001）。
   3.2 DNA凝集检测
   与对照组进行比较，在一般浓度下处理15 min后（图1A），无防腐卡波姆934P诱导了烟酸己可碱荧光的显著降低（平均荧光强度为对照组的62%，P=0.0025），防腐卡波姆934P以及BAC则引起了烟酸己可碱荧光强度的显著升高（分别为对照组的189%和381%，P=0.0007和P<0.0001），无防腐和防腐HA组都没有观察到明显改变（分别为对照组的108%和119%，无显著性差异，P=0.1856和P=0.0536）。在1:10稀释情况下(图1B)，只有BAC组观察到了染色质凝集(为对照组的138%，P=0.0025)。
   在24 h的细胞恢复期后，一般浓度下（图2A），无防腐和防腐的HA组没有观察到对烟酸己可碱荧光的显著改变（平均荧光强度分别为对照组的92%和93%），无防腐卡波姆组的烟酸己可碱荧光则产生了显著降低（为对照组的83%，P=0.0235），防腐卡波姆和BAC组则诱导产生了荧光的显著升高（分别为对照组的123%和264%，P=0.013和P<0.0001）。在1:10稀释的情况下（图2B），只有BAC组引起了烟酸己可碱荧光强度的显著升高（为对照组的150%，P=0.0011）。

  图2 处理15 min后延长细胞恢复期24h
细胞活性检测

   说明:在分别以卡波姆934P、玻璃酸或BAC处理细胞15min后延长细胞恢复期24h细胞活性检测，DNA凝集。图的纵坐标为与对照组比较的荧光强度（%）。结果以占对照组的百分比表示（水平实线）。(A) 一般浓度下的水凝胶检测结果(B) 水凝胶和BAC在标准培养基中以1:10稀释后检测结果。与对照组比较*P=0.05; **P= 0.01, ***P=0.001。
   经过15 min实验处理以及在15 min处理后延长24 h的细胞恢复期（图1，图2）这两种实验时间段中，无防腐和防腐的HA以及无防腐和防腐卡波姆934P诱导烟酸己可碱荧光都显著低于BAC组（所有检测浓度与BAC组相比P<0.0001）。防腐卡波姆934P和防腐HA即使在使用了相同浓度的BAC时引发的染色质凝集也比单独的BAC所引发的低。
   无防腐和防腐HA组间没有发现烟酸己可碱荧光的显著差异，0.3%防腐卡波姆引起的烟酸己可碱荧光则显著高于0.3%无防腐卡波姆（P<0.0001）。
   3.3 HE试验检测生成
   与对照组比较，BAC可以引起浓度依赖性合成（BAC浓度分别为0.0005%和0.005%时的平均荧光强度分别为对照组的118%和142%，P=0.0381和P=0.0019）。在一般浓度下，无防腐和防腐HA以及无防腐和防腐卡波姆934P都诱导了生成的显著降低。（平均荧光强度分别为对照组的21%和33%以及21%和24%， P=0.0005、 P=0.0003和P=0.0003； 图1A），在1:10稀释的浓度下则都没有发生显著改变（图1B）。
   4种水凝胶在所有检测浓度下荧光都显著低于BAC组（P<0.0001，图1A）。
   此外，浓度为0.18%的无防腐玻璃酸与防腐配方相比所产生的诱导HE荧光有明显降低（P=0.0325），无防腐和防腐卡波姆试验组间在此项中没有显著差异。（图1A）
   3.4 DCFH-DA试验检测H2O2生成
  与对照组比较，只有浓度为0.005%和0.0005%的BAC引起了过氧化氢生成增加(平均荧光强度分别为对照组的165%和195%，P=0.0006和P=0.0002)。无防腐和防腐HA以及无防腐和防腐卡波姆934P在一般浓度下都对荧光有显著减低(分别为对照组的14%、66%、30%和56%，P=0.0003、P=0.003、 P=0.0005和P<0.0013，图1A)。
   4种水凝胶在所有检测浓度下的荧光强度都显著低于BAC组（与BAC组比较P<0.0001，在与BAC相同浓度下检测）。此外无防腐卡波姆和无防腐HA诱导的DCFH-DA荧光都显著低于防腐配方组（P=0.0002和P<0.0001，图1A）。
   3.5 形态学改变
   在用BAC处理细胞时观察到了浓度依赖性的细胞缩小，HA、卡波姆934P或各防腐水凝胶都没有引起细胞形态的改变。这个结果证实无防腐的水凝胶在体外没有毒性作用而且防腐配方不会引起细胞形态的改变，表明各种水凝胶都具有对抗BAC毒性的保护作用。

   4 讨论
   水凝胶是一种可以在水或水性溶剂中溶胀并且引起液体-胶体转换的聚合物。这些商业化产品的优点在于其具有良好的耐受性、更长的眼表面接触时间以及与泪液较好的互溶性。它们可以提高眼科药物的生物利用度以及降低局部用药的全身吸收引起的副作用。
   本研究证实以浓度为0.3%无防腐卡波姆934P处理15 min后与对照组相比没有产生毒性作用，然而防腐卡波姆934P引起了显著的细胞活性下降。但即使采用了与单独BAC相同的浓度的BAC作为防腐剂时产生的毒性，也比单独BAC毒性作用低，这就表明卡波姆934P具有一定的保护作用。在24h的细胞恢复期后观察到了这两种卡波姆与对照组相比引起了显著的细胞活性降低。究其原因可能归结于卡波姆产生的很高的溶液黏度。其中两次实验都发现了染色质凝集，0.3%无防腐卡波姆产生了显著的烟酸己可碱荧光降低，然而0.3%防腐卡波姆则产生了烟酸己可碱荧光增强，但都明显低于BAC组。在24h的细胞恢复期后观察到的烟酸己可碱荧光的增加要低于处理15min后，表明这种毒性作用是可逆的。卡波姆对抗BAC毒性的保护作用可能是由于其阻止了眼表面与BAC的直接接触，而不是特殊的细胞作用。
   这些实验结果与临床结果是一致的，以玻璃酸钠治疗病人2年没有发现不良反应，这也与早先的以鸡为模型的毒性作用的实验中得出的结论一致。最近，有报道发现含有0.005%BAC的0.15% HA对牛结膜内皮细胞未产生任何形态学和功能的改变，虽然在实验中观察到了上皮电阻的缓慢下降（但是与单独BAC比较则并不严重）。
   一种可能的合理解释是BAC的正电荷与多阴离子聚合物（羧甲基纤维素、卡波姆、玻璃酸钠）发生离子吸引从而中和了季铵阳离子对结膜和角膜上皮的毒性作用。还有可能是BAC分子进入玻璃酸钠形成的海绵状结构区内并且分散在其中。另外一种假说是季铵阳离子防腐剂与阴离子聚合物之间的结合可以使防腐剂与细胞膜的结合平衡向解离的方向移动，从而减轻细胞毒性作用。防腐剂与水凝胶的结合可受如防腐剂分子性质以及与水凝胶分子作用平衡中的游离态浓度等因素影响。
   此外，对超微结构的研究也表明玻璃酸钠对角膜上皮细胞对抗干燥的保护作用要优于羟乙基纤维素或是PBS。这些结果与对白内障手术时进行的对各种保护性溶液的临床试验的初的结果是一致的。玻璃酸钠的保护作用可能可以归因于其多糖链与滞留水（trapped water）形成的特殊的海绵状结构。假定这些水分子由玻璃酸钠溶液中缓慢释放出来，提供了一种湿润的介质更好的保护上皮细胞。
   在治疗干眼病的临床研究中，玻璃酸钠可以增加泪液膜的稳定性并且减轻如沙粒感和烧灼感等主观症状。对于个别很多黏弹性溶液作为泪液替代物在临床上的成功应用确证了他们没有细胞毒性。此外玻璃酸钠可以至少覆盖角膜上皮1h。
   综上所述，HA和卡波姆934P在体外试验中除了不具有毒性外还具有抗氧化性，并且这两种水凝胶与BAC连用时可以降低防腐剂引起的毒性作用。此外，含有HA的泪液替代物对眼表面的保护较强。通过向眼药中加入低浓度的水凝胶即可使耐受性获得可观的提高，但是需要谨慎的将这些体外试验的结果外推到临床应用环境下。在做最终的结论前还需对水凝胶在人眼表面的作用加以更进一步的研究。
   (原文为Caroline Debbasch等, Cytoprotective effects of hyaluronic acid and carbomer 934P in ocular surface epithelial cells.。刊于Investigative Ophthalmology & Visual Science,November 2002,vol.43, No.11,3409-3415.)

刘艳，边玲编译，张天民校